Tankewol foar it besykjen fan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe. Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side werjaan sûnder stilen en JavaScript.
Thermophilen binne mikroorganismen dy't bloeie by hege temperatueren. It studearjen fan har kin weardefolle ynformaasje leverje oer hoe't it libben har oanpast oan ekstreme omstannichheden. It is lykwols lestich om hege temperatueromstannichheden te berikken mei konvinsjonele optyske mikroskopen. Ferskate selsmakke oplossingen basearre op lokale resistive elektryske ferwaarming binne foarsteld, mar d'r is gjin ienfâldige kommersjele oplossing. Yn dit papier yntrodusearje wy it konsept fan mikroskaal laserferwaarming oer it sichtfjild fan 'e mikroskoop om hege temperatueren te leverjen foar thermofiele stúdzjes, wylst de omjouwing fan' e brûker myld wurdt. Microscale ferwaarming by matige laser yntinsiteit kin berikt wurde mei help fan in gouden nanopartikel coated substraat as in biocompatible en effisjinte ljocht absorber. Mooglike effekten fan mikroskaal floeistofkonveksje, selbehâld, en sintrifugale thermophoretyske beweging wurde besprutsen. De metoade is oantoand yn twa soarten: (i) Geobacillus stearothermophilus, in aktive thermofiele baktearje dy't reprodusearret op sa'n 65 ° C, dêr't wy hawwe waarnommen te ûntkiemen, groeie en swimme ûnder mikroskaal ferwaarming; (ii) Thiobacillus sp., in optimaal hyperthermofile archaea. op 80°C. Dit wurk makket it paad foar ienfâldige en feilige observaasje fan thermofilyske mikroorganismen mei moderne en betelbere mikroskopy-ark.
Yn 'e rin fan miljarden jierren is it libben op ierde evoluearre om oan te passen oan in breed skala oan omjouwingsomstannichheden dy't soms as ekstreem beskôge wurde út ús minsklik perspektyf. Benammen guon thermophilic mikro-organismen (baktearjes, archaea, fungi) neamd thermophiles bloeie yn it temperatuer berik fan 45 ° C oant 122 ° C1, 2, 3, 4. Thermophiles libje yn ferskate ekosystemen, lykas djippe see hydrothermal fentilaasje, waarme boarnen of fulkanyske gebieten. Harren ûndersyk hat yn 'e ôfrûne pear desennia in protte belangstelling opwekke om op syn minst twa redenen. Earst kinne wy fan har leare, bygelyks hoe't thermofilen 5, 6, enzymen 7, 8 en membranen 9 stabyl binne by sokke hege temperatueren, of hoe't thermofilen ekstreem nivo's fan strieling kinne ferneare10. Twadder binne se de basis foar in protte wichtige biotechnologyske tapassingen1,11,12 lykas brânstofproduksje13,14,15,16, gemyske synteze (dihydro, alkoholen, metaan, aminosoeren, ensfh.)17, biomining18 en thermostabile biokatalysatoren7 ,11, 13. Benammen by de op it stuit bekende polymerasekettingreaksje (PCR)19 giet it om in enzyme (Taq polymerase) isolearre út de thermofiele baktearje Thermus aquaticus, ien fan de earste thermofilen dy't ûntdutsen binne.
De stúdzje fan thermofilen is lykwols gjin maklike taak en kin net yn elk biologysk laboratoarium ymprovisearre wurde. Benammen libbene thermofilen kinne net yn vitro waarnommen wurde mei elke standert ljochtmikroskoop, sels mei kommersjeel beskikbere ferwaarmingskeamers, meastentiids beoardiele foar temperatueren sa leech as 40 ° C. Sûnt de jierren '90 hawwe mar in pear ûndersyksgroepen har ynset foar de ynfiering fan systemen foar hege temperatuermikroskopy (HTM). In 1994 Glukh et al. De ferwaarming / koeling keamer waard betocht basearre op it brûken fan in Peltier sel dy't kontrolearret de temperatuer fan rjochthoekige kapillaren sluten te behâlden anaerobicity 20. It apparaat kin wurde ferwaarme oant 100 ° C mei in snelheid fan 2 ° C / s, wêrtroch't de auteurs de motiliteit fan 'e hyperthermofile baktearje Thermotoga maritima21 kinne studearje. In 1999, Horn et al. In hiel ferlykber apparaat is ûntwikkele, noch altyd basearre op it brûken fan ferwaarme kapillaren geskikt foar kommersjele mikroskopy te bestudearjen sel ferdieling / ferbining. Nei in lange perioade fan relative ynaktiviteit waard it sykjen nei effektive HTM's opnij yn 2012, benammen yn ferbân mei in searje papieren fan 'e Wirth-groep dy't in apparaat brûkte útfûn troch Horn et al. Fyftjin jier lyn waard de motiliteit fan in grut oantal archaea, ynklusyf hyperthermophilen, ûndersocht by temperatueren oant 100 ° C mei help fan ferwaarme kapillaren23,24. Se hawwe ek de orizjinele mikroskoop wizige om rapper ferwaarming te berikken (ferskate minuten ynstee fan 35 minuten om de ynstelde temperatuer te berikken) en in lineêre temperatuergradient fan mear as 2 sm oer it medium te berikken. Dit temperatuergradientfoarmjende apparaat (TGFD) is brûkt om de mobiliteit fan in protte thermofilen te studearjen binnen temperatuergradiënten op biologysk relevante ôfstannen 24, 25 .
Ferwaarming fan sletten kapillaren is net de ienige manier om live thermofilen te observearjen. In 2012, Kuwabara et al. Homemade disposable Pyrex keamers fersegele mei waarmte-resistant adhesive (Super X2; Cemedine, Japan) waarden brûkt. De samples waarden pleatst op in kommersjeel beskikber transparante ferwaarming plaat (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) by steat om te ferwaarmjen oant 110 ° C, mar net oarspronklik bedoeld foar bioimaging. De auteurs observearre effisjinte divyzje fan anaërobe thermofilyske baktearjes (Thermosipho globiformans, ferdûbelingstiid 24 min) by 65 ° C. In 2020, Pulshen et al. Effisjinte ferwaarming fan kommersjele metalen skûtels (AttofluorTM, Thermofisher) waard oantoand mei twa selsmakke ferwaarming eleminten: in lid en in poadium (PCR masine-ynspirearre konfiguraasje). Dizze assosjaasje resultearret yn in unifoarm floeibere temperatuer en foarkomt ferdamping en kondensaasje oan 'e ûnderkant fan it lid. It brûken fan in O-ring foarkomt gasútwikseling mei it miljeu. Dizze HTM, neamd de Sulfoscope, waard brûkt om Sulfolobus acidocaldarius by 75 ° C27 ôfbyld te meitsjen.
In erkende beheining fan al dizze systemen wie de beheining foar it brûken fan loftdoelen, elke oalje-ûnderdompeling wie net geskikt foar sokke hege temperatueren en foar ôfbylding troch> 1 mm dikke transparante samples. In erkende beheining fan al dizze systemen wie de beheining foar it brûken fan loftdoelen, elke oalje-ûnderdompeling wie net geskikt foar sokke hege temperatueren en foar ôfbylding troch> 1 mm dikke transparante samples. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объектив, колектив е погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачнцые 1 маслизации >. In erkend tekoart fan al dizze systemen wie de beheining foar it brûken fan loftdoelen, om't elke oalje-ûnderdompeling net geskikt wie foar sa'n hege temperatuer en foar fisualisaasje troch transparante samples > 1 mm dik.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜, 任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1 毫米厚的透明样品成像. In erkende beheining fan al dizze systemen is de beheining fan it brûken fan in lucht-entrained spegel, as eltse oalje immersion is net geskikt foar imaging transparante samples> 1 mm dik by sokke hege temperatueren. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объектин ружение в масло непригодно для таких высоких температур en визуализации через прозрачные образцы мобразци мобразцы тобразцы тобразцы тобразцы тобразцы можно. In erkend neidiel fan al dizze systemen is it beheinde gebrûk fan loftlinsjes, elke oalje-ûnderdompeling is net geskikt foar sokke hege temperatueren en fisualisaasje fia transparante samples> 1 mm dik.Mear resint waard dizze beheining opheft troch Charles-Orzag et al. 28, dy't ûntwikkele in apparaat dat net mear jout waarmte om it systeem fan belang, mar leaver binnen de cover glês sels, bedekt mei in tinne transparante laach fan in wjerstân makke fan ITO (indium-tin okside). It lid kin ferwaarme wurde oant 75 °C troch in elektryske stroom troch de transparante laach te stjoeren. De auteur moat lykwols ek de lens oant it objektyf ferwaarme, mar net mear as 65 °C, om dy net te beskeadigjen.
Dizze wurken litte sjen dat de ûntwikkeling fan effisjinte optyske mikroskopy mei hege temperatuer net breed oannommen is, faaks selsmakke apparatuer fereasket en faaks wurdt berikt op kosten fan romtlike resolúsje, wat in serieus neidiel is, sjoen dat thermofiele mikroorganismen net grutter binne as in pear mikrometers. Fermindere ferwaarmingsvolumint is de kaai foar it oplossen fan trije ynherinte problemen fan HTM: minne romtlike resolúsje, hege thermyske inertia as it systeem opwaarmt, en skealike ferwaarming fan omlizzende eleminten (immersion oalje, objektive lens ... of brûker syn hannen) by ekstreme temperatueren. ).
Yn dit papier yntrodusearje wy in HTM foar thermophile observaasje dy't net basearre is op resistive ferwaarming. Ynstee dêrfan berikten wy lokale ferwaarming binnen in beheind gebiet fan it sichtfjild fan 'e mikroskoop troch laserbestraling fan in ljochtabsorberend substraat. De temperatuerferdieling waard visualisearre mei kwantitative fazemikroskopie (QPM). De effektiviteit fan dizze metoade wurdt oantoand troch Geobacillus stearothermophilus, in beweeglike thermofiele baktearje dy't reprodusearret op sa'n 65 ° C en hat in koarte ferdûbeling tiid (sawat 20 minuten), en Sulfolobus shibatae, in hyperthermophilus dat groeit optimaal by 80 ° C (archaea) te yllustrearjen. Normale replikaasjefrekwinsje en swimmen waarden waarnommen as funksje fan temperatuer. Dizze laser HTM (LA-HTM) wurdt net beheind troch de dikte fan 'e deksel of troch de aard fan it objektyf (loft- of oalje-ûnderdompeling). Hjirmei kin elke lens mei hege resolúsje op 'e merke wurde brûkt. It hat ek gjin lêst fan trage ferwaarming troch termyske inertia (beriket direkte ferwaarming op in millisekonde skaal) en brûkt allinich kommersjeel beskikbere komponinten. De ienige nije feiligensproblemen binne relatearre oan de oanwêzigens fan krêftige laserstralen (typysk oant 100 mW) binnen it apparaat en mooglik troch de eagen, dy't beskermjende bril nedich binne.
It prinsipe fan LA-HTM is om in laser te brûken om de stekproef lokaal binnen it sichtfjild fan 'e mikroskoop te ferwaarmjen (fig. 1a). Om dit te dwaan, moat it monster ljocht-absorberend wêze. Om in ridlike laserkrêft (minder as 100 mW) te brûken, hawwe wy net op 'e absorption fan ljocht troch it floeibere medium fertrouwe, mar de absorption fan' e stekproef keunstmjittich fergrutte troch it substraat mei gouden nanopartikels te beklaaien (Fig. 1c). It ferwaarmjen fan gouden nanopartikels mei ljocht is fan fûnemintele belang foar it fjild fan thermyske plasmonika, mei ferwachte tapassingen yn biomedisyn, nanochemistry of sinneljocht rispinge29,30,31. Yn 'e ôfrûne jierren hawwe wy dizze LA-HTM brûkt yn ferskate stúdzjes yn ferbân mei thermyske plasma-applikaasjes yn natuerkunde, skiekunde en biology. De wichtichste muoite mei dizze metoade is it werjaan fan it definitive temperatuerprofyl, om't de ferhege temperatuer beheind is ta in mikroskaalregio binnen it stekproef. Wy hawwe sjen litten dat temperatuer mapping kin wurde berikt mei de fjouwer-golflingte transverse shear interferometer, in ienfâldige, hege-resolúsje, en hiel gefoelige metoade fan kwantitative faze mikroskopy basearre op it brûken fan twadimensjonale diffraksje gratings (ek wol bekend as cross gratings) 33,34,35,36. De betrouberens fan dizze termyske mikroskopytechnyk, basearre op crossed grating wavefront mikroskopy (CGM), is oantoand yn in tsiental papieren publisearre oer de ôfrûne desennia37,38,39,40,41,42,43.
Skema fan ynstallaasje fan parallelle laser ferwaarming, foarmjouwing en temperatuer mikroskoop. b Sample mjitkunde besteande út in Attofluor TM keamer mei dêryn in coverslip bedekt mei gouden nanopartikels. c Sjoch goed nei it stekproef (net op skaal). d stiet foar de unifoarme laser beam profyl en (e) de simulearre folgjende temperatuer ferdieling op de stekproef fleanmasine fan de gouden nanopartikels. f is in annular laser beam profyl geskikt foar it generearjen fan in unifoarm temperatuer lykas werjûn yn de simulaasje fan de resultearjende temperatuer ferdieling werjûn yn (g). Skaalbalke: 30 µm.
Benammen hawwe wy koartlyn berikt ferwaarming fan sûchdiersellen mei LA-HTM en CGM en folge sellulêre waarmte-skok-antwurden yn it berik fan 37-42 ° C, wat de tapasberens fan dizze technyk oanwize foar ôfbylding fan ien libbene sel. De tapassing fan LA-HTM foar de stúdzje fan mikro-organismen by hege temperatueren is lykwols net ûndûbelsinnich, om't it mear foarsichtigens fereasket yn ferliking mei sûchdiersellen: earst liedt it ferwaarmjen fan 'e boaiem fan it medium troch tsientallen graden (ynstee fan in pear graden) nei in sterke fertikale temperatuergradient. kin meitsje floeiber convection 44 dy't, as net stevich hechte oan it substraat, kin feroarsaakje net winske beweging en mingen fan baktearjes. Dizze konveksje kin wurde elimineare troch de dikte fan 'e floeibere laach te ferminderjen. Foar dit doel, yn alle eksperiminten presintearre hjirûnder, baktearjele suspensions waarden pleatst tusken twa coverslips likernôch 15 µm dik pleatst binnen in metalen beker (Attofluor TM, Thermofisher, Fig. 1b, c). Yn prinsipe kin konveksje foarkommen wurde as de dikte fan 'e floeistof lytser is as de beamgrutte fan' e ferwaarmingslaser. Twad, wurkjen yn sa'n beheinde mjitkunde kin aerobyske organismen fersmoargje (sjoch Fig. S2). Dit probleem kin foarkommen wurde troch it brûken fan in substraat dat is permeable foar soerstof (of in oar fitale gas), troch it ferlitten fan fongen lucht bubbels binnen de coverslip, of troch it boarjen fan gatten yn de top coverslip (sjoch Fig. S1) 45. Yn dit ûndersyk hawwe wy de lêste oplossing keazen (figueren 1b en S1). Ta beslút, laser ferwaarming net jouwe unifoarme temperatuer ferdieling. Sels by deselde yntinsiteit fan 'e laserstraal (fig. 1d), is de temperatuerferdieling net unifoarm, mar liket earder op 'e Gaussyske ferdieling troch termyske diffusion (fig. 1e). As it doel is om krekte temperatueren op it mêd fan sicht te fêstigjen foar it bestudearjen fan biologyske systemen, binne unjildige profilen net ideaal en kinne ek liede ta thermophoretyske beweging fan baktearjes as se net oan it substraat hâlde (sjoch Fig. S3, S4)39. Dêrta brûkten wy in romtlike ljochtmodulator (SLM) om de ynfraread laserstraal te foarmjen neffens de foarm fan 'e ring (Fig. 1f) yn it fleantúch fan' e stekproef om in perfekt unifoarme temperatuerferdieling binnen in opjûn geometrysk gebiet te berikken, nettsjinsteande termyske diffusion (figuer 1d) 39, 42, 46. Plak in top coverslip oer in metalen skûtel (figuer 1b) foar te kommen ferdamping fan it medium en observearje op syn minst in pear dagen. Om't dizze topdekslip net fersegele is, kin ekstra medium op elk momint maklik wurde tafoege as nedich.
Om te yllustrearjen hoe't LA-HTM wurket en syn tapasberens yn termofylysk ûndersyk te demonstrearjen, hawwe wy de aerobe baktearjes Geobacillus stearothermophilus studearre, dy't in optimale groeitemperatuer hawwe fan sawat 60-65 °C. De baktearje hat ek flagella en it fermogen om te swimmen, wat in oare yndikator leveret fan normale sellulêre aktiviteit.
Samples (Fig. 1b) waarden pre-incubated by 60 ° C foar ien oere en dan pleatst yn in LA-HTM sample holder. Dizze pre-incubation is opsjoneel, mar noch brûkber, foar twa redenen: As earste, as de laser wurdt ynskeakele, it feroarsaket de sellen om te groeien en ferdiele (sjoch film M1 yn Supplementary Materials). Sûnder pre-incubation, baktearjele groei wurdt typysk fertrage mei likernôch 40 minuten eltse kear in nij besjen gebiet wurdt ferwaarme op it stekproef. Twads, de 1 oere pre-incubation befoardere adhesion fan de baktearjes oan de coverslip, foarkommen sellen út drifting út it fjild fan sicht fanwege thermophoresis doe't de laser waard ynskeakele (sjoch film M2 yn Supplementary Materials). Thermophoresis is de beweging fan dieltsjes of molekulen lâns in temperatuergradient, meastentiids fan hjit oant kâld, en baktearjes binne gjin útsûndering43,47. Dit net winske effekt wurdt eliminearre oer in bepaald gebiet troch SLM te brûken om de laserstraal te foarmjen en in flakke temperatuerferdieling te berikken.
Op fig. Figure 2 toant de temperatuer ferdieling mjitten troch CGM krigen troch irradiating in glêzen substraat bedekt mei gouden nanopartikels mei in annular laser beam (figuer 1f). In flakke temperatuerferdieling waard waarnommen oer it hiele gebiet bedekt troch de laserbeam. Dizze sône waard ynsteld op 65 ° C, de optimale groeitemperatuer. Bûten dit gebiet falt de temperatuerkromme fansels nei \(1/r\) (wêr't \(r\) de radiale koördinaat is).
in temperatuerkaart fan CGM-mjittingen krigen troch it brûken fan in ringfoarmige laserstraal om in laach gouden nanopartikels te bestralen om in flak temperatuerprofyl oer in sirkulêr gebiet te krijen. b Isoterm fan de temperatuerkaart (a). De kontoer fan de laser beam wurdt fertsjintwurdige troch in grize stippele sirkel. It eksperimint waard twa kear werhelle (sjoch Oanfoljende materialen, figuer S4).
De leefberens fan baktearjesellen waard ferskate oeren kontrolearre mei LA-HTM. Op fig. 3 toant de tiid ynterval foar fjouwer bylden nommen út in 3 oere 20 minuten film (Movie M3, Oanfoljende ynformaasje). Baktearjes waarden waarnommen om aktyf te proliferearjen binnen it sirkulêre gebiet definieare troch de laser wêr't de temperatuer optimaal wie, tichtby 65 ° C. Yn tsjinstelling, sel groei waard signifikant fermindere doe't de temperatuer foel ûnder 50 ° C foar 10 s.
Optyske djipte bylden fan G. stearothermophilus baktearjes groeie nei laser ferwaarming op ferskillende tiden, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, út 200 Extrakt út in film fan ien minút (M3-film levere yn Oanfoljende ynformaasje) boppe op 'e oerienkommende temperatuerkaart. De laser giet op tiid \(t=0\). Isothermen binne tafoege oan it yntensiteitsôfbylding.
Om fierder te kwantifisearjen sel groei en syn ôfhinklikheid fan temperatuer, wy mjitten de ferheging fan biomassa fan ferskate koloanjes fan yn earste ynstânsje isolearre baktearjes yn de Movie M3 sichtfjild (figuer 4). De âlder baktearjes selektearre oan it begjin fan mini koloanje foarmjen ienheid (mCFU) formaasje wurde werjûn yn figuer S6. Drye massamjittingen waarden nommen mei in CGM 48-kamera dy't brûkt waard om de temperatuerferdieling yn kaart te bringen. It fermogen fan 'e CGM om droech gewicht en temperatuer te mjitten is de krêft fan' e LA-HTM. Lykas ferwachte, feroarsake hege temperatuer flugger baktearjele groei (figuer 4a). Lykas werjûn yn it semi-log-plot yn Fig. 4b, folget groei by alle temperatueren eksponinsjele groei, wêrby't de gegevens de eksponinsjele funksje \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau}+ brûke {{ \mbox{cst}}}\), dêr't \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}}2\) – generaasjetiid (of ferdûbelingstiid), \( g =1/ \tau\) - groei taryf (oantal divyzjes per ienheid tiid). Op fig. 4c lit de respektivelike groeisnelheid en generaasjetiid sjen as funksje fan temperatuer. Snel groeiende mCFU's wurde karakterisearre troch sêding fan groei nei twa oeren, in ferwachte gedrach fanwege hege baktearjele tichtens (lykas de stasjonêre faze yn klassike floeibere kultueren). De algemiene foarm \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) komt oerien mei de ferwachte twa-fase kromme foar G. stearothermophilus mei in optimale groei rate om 60-65 ° C. Match de gegevens mei in kardinaalmodel (figuer S5)49 wêr't \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt}} ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, wat goed oerienkomt mei oare wearden dy't yn de literatuer oanhelle binne49. Hoewol't de temperatuer ôfhinklike parameters binne reproducible, de maksimale groei taryf fan \({G}_{0}\) kin fariearje fan it iene eksperimint nei it oare (sjoch figueren S7-S9 en film M4). Yn tsjinstelling ta temperatuerpasparameters, dy't universeel moatte wêze, hinget de maksimale groeisnelheid ôf fan 'e eigenskippen fan it medium (beskikberens fan fiedingsstoffen, soerstofkonsintraasje) binnen de waarnommen mikroskaal geometry.
a Microbial groei by ferskate temperatueren. mCFU: Miniature Colony Forming Units. Gegevens krigen fan in fideo fan in inkele baktearje dy't groeit yn in temperatuergradient (film M3). b Itselde as (a), semy-logaritmyske skaal. c Groeisnelheid\(\tau\) en generaasjetiid\(g\) berekkene út lineêre regression (b). Horizontale flaterbalken: temperatuerberik wêryn mCFU's útwreide yn it sichtfjild tidens groei. Fertikale flaterbalken: lineêre regression standert flater.
Njonken normale groei sweeven guon baktearjes soms yn sicht by laserferwaarming, wat in ferwachte gedrach is foar baktearjes mei flagella. De film M5 yn oanfoljende ynformaasje toant sokke swimmen aktiviteiten. Yn dit eksperimint waard unifoarme laserstraling brûkt om in temperatuergradient te meitsjen, lykas werjûn yn figueren 1d, e en S3. Figuer 5 toant twa ôfbyldingssekwinsjes selekteare út 'e M5-film dy't sjen litte dat ien baktearje rjochtingsbeweging eksposearret, wylst alle oare baktearjes roerloos bliuwe.
De twa tiidframes (a) en (b) litte it swimmen sjen fan twa ferskillende baktearjes markearre mei stippele sirkels. De ôfbyldings binne helle út 'e M5-film (foarsjoen as oanfoljend materiaal).
Yn it gefal fan G. stearothermophilus begon de aktive beweging fan baktearjes (fig. 5) in pear sekonden nei't de laserstraal ynskeakele waard. Dizze observaasje beklammet de tydlike reaksje fan dit thermophilic mikroorganisme op in ferheging fan temperatuer, lykas al beoardiele troch Mora et al. 24 . It ûnderwerp fan baktearjende motiliteit en sels thermotaksis kin fierder ûndersocht wurde mei LA-HTM.
Mikrobiaal swimmen moat net betize wurde mei oare soarten fysike beweging, nammentlik (i) Brownske beweging, dy't chaotyske beweging liket te wêzen sûnder bepaalde rjochting, (ii) konveksje 50 en thermophoresis 43, besteande út in reguliere beweging fan beweging lâns in temperatuer gradient.
G. stearothermophilus is bekend om syn fermogen om te produsearjen tige resistinte sporen (spore formaasje) doe't bleatsteld oan ûngeunstige omjouwingsomstannichheden as ferdigening. As de omjouwingsomstannichheden wer geunstich wurde, ûntkiemen de sporen, foarmje libbene sellen en begjinne de groei wer. Hoewol dit sporulaasje- / kiemingsproses goed bekend is, is it nea yn echt tiid waarnommen. Mei LA-HTM melde wy hjir de earste observaasje fan kiemingseveneminten yn G. stearothermophilus.
Op fig. 6a toant time-lapse bylden fan optyske djipte (OT) krigen mei help fan in CGM set fan 13 sporen. Foar de hiele sammeltiid (15 h 6 min, \(t=0\) - it begjin fan laserferwaarming), ûntkiemen 4 fan de 13 sporen, op opfolgjende tiidpunten \(t=2\) h, \(3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' en \(11\) h \(30\)'. Hoewol mar ien fan dizze eveneminten wurdt werjûn yn figuer 6, kinne 4 kiemingseveneminten wurde waarnommen yn 'e M6 film yn it oanfoljende materiaal. Nijsgjirrich is dat kieming willekeurich liket te wêzen: net alle sporen kieme en kieme net tagelyk, nettsjinsteande deselde feroaringen yn miljeuomstannichheden.
a Time-lapse besteande út 8 OT bylden (oalje immersion, 60x, 1,25 NA objektiv) en (b) biomassa evolúsje fan G. stearothermophilus aggregates. c (b) Tekene op in semy-log-skaal om de lineariteit fan 'e groeirate te markearjen (stiple line).
Op fig. 6b,c toant de biomassa fan selpopulaasjes yn it sichtfjild as funksje fan tiid oer de hiele perioade fan gegevenssammeling. It rappe ferfal fan de droege massa waarnommen by \(t=5\)h yn fig. 6b, c, fanwege de útgong fan guon sellen út it sichtfjild. De groei fan dizze fjouwer eveneminten is \(0.77\pm 0.1\) h-1. Dizze wearde is heger as de groei taryf ferbûn mei figuer 3. 3 en 4, dêr't sellen groeie normaal. De reden foar de ferhege groei fan G. stearothermophilus fan sporen is ûndúdlik, mar dizze mjittingen markearje de belangstelling fan LA-HTM en wurkje op it single-cell-nivo (of op it single mCFU-nivo) om mear te learen oer de dynamyk fan sel libben .
Om fierder te demonstrearjen de veelzijdigheid fan LA-HTM en syn prestaasjes by hege temperatueren, wy ûndersocht de groei fan Sulfolobus shibatae, in hyperthermophilic acidophilic archaea mei in optimale groei temperatuer fan 80 ° C51. Yn ferliking mei G. stearothermophilus hawwe dizze archaea ek in hiel oare morfology, dy't lykje op 1 mikron sfearen (kokken) ynstee fan langwerpige roeden (bazilli).
figuer 7a bestiet út sekwinsjele optyske djipte bylden fan S. shibatae mCFU krigen mei help fan CGM (sjoch M7 feature film yn oanfoljende materialen). Dizze mCFU groeit om 73 ° C, ûnder de optimale temperatuer fan 80 ° C, mar binnen it temperatuergebiet foar aktive groei. Wy observearre meardere fission eveneminten dy't makke mCFUs lykje op micrograpes fan archaea nei in pear oeren. Fan dizze OT-ôfbyldings waard mCFU-biomassa oer tiid mjitten en presintearre yn figuer 7b. Ynteressant toande S. shibatae mCFUs lineêre groei ynstee fan de eksponinsjele groei sjoen mei G. stearothermophilus mCFUs. D'r is in lange-steande diskusje 52 oer de aard fan sel groei tariven: wylst guon stúdzjes rapportearje groei tariven fan mikroben dy't evenredich binne oan harren grutte (eksponinsjele groei), oaren litte in konstante taryf (lineêre of bilineêre groei). Lykas útlein troch Tzur et al.53, it ûnderskied tusken eksponinsjele en (bi)lineêre groei fereasket in krektens fan <6% yn biomassa mjittingen, dat is bûten berik foar de measte QPM techniken, sels wêrby't interferometry. Lykas útlein troch Tzur et al.53, it ûnderskied tusken eksponinsjele en (bi)lineêre groei fereasket in krektens fan <6% yn biomassa mjittingen, dat is bûten berik foar de measte QPM techniken, sels wêrby't interferometry. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального en (mei) линейного роста требует точности fan <6% вис достижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. As útlein troch Zur et al.53, it ûnderskied tusken eksponinsjele en (bi) lineêre groei fereasket <6% krektens yn biomassa mjittingen, dat is net te berikken foar de measte QPM metoaden, sels mei help fan interferometry.As útlein troch Zur et al. 53, it ûnderskieden tusken eksponinsjele en (bi)lineêre groei fereasket minder dan 6% krektens yn biomassamjittingen, wat net te berikken is foar de measte QPM-metoaden, sels as ynterferometry wurdt brûkt. CGM berikt dizze krektens mei sub-pg krektens yn biomassa mjittingen36,48.
in Time-lapse besteande út 6 OT ôfbyldings (oalje immersion, 60x, NA objektive 1.25) en (b) micro-CFU biomassa evolúsje mjitten mei CGM. Sjoch film M7 foar mear ynformaasje.
De perfekt lineêre groei fan S. shibatae wie ûnferwachts en is noch net rapportearre. Eksponinsjele groei wurdt lykwols ferwachte, teminsten om't oer de tiid meardere divyzjes fan 2, 4, 8, 16 ... sellen moatte foarkomme. Wy hypoteze dat lineêre groei kin wurde feroarsake troch sel ynhibysje fanwege dichte sel ynpakke, krekt sa't sel groei fertraget en úteinlik berikt in sliepende steat as sel tichtens is te heech.
Wy konkludearje troch it besprekken fan de folgjende fiif punten fan belang yn 'e beurt: reduksje yn ferwaarming folume, reduksje yn termyske inertia, belangstelling foar gouden nanopartikels, belangstelling foar kwantitative faze mikroskopy, en in mooglik temperatuer berik wêryn LA-HTM kin brûkt wurde.
Yn ferliking mei resistive ferwaarming, laser ferwaarming brûkt foar HTM ûntwikkeling biedt ferskate foardielen, dy't wy yllustrearje yn dizze stúdzje. Benammen yn floeibere media yn it sichtfjild fan 'e mikroskoop wurdt it ferwaarmingsvolumint binnen in pear (10 μm) 3 folumes hâlden. Op dizze manier binne allinich de waarnommen mikroben aktyf, wylst oare baktearjes dormant binne en kinne wurde brûkt om de stekproef fierder te studearjen - it is net nedich om it probleem te feroarjen elke kear as in nije temperatuer kontrolearre wurde moat. Dêrneist microscale ferwaarming kinne direkte ûndersyk fan in grut oanbod fan temperatueren: Figure 4c waard krigen fan in 3-oere film (Movie M3), dy't meastal fereasket de tarieding en ûndersyk fan ferskate gebrûk - ien foar elk fan 'e gebrûk ûnder stúdzje. y is de temperatuer foar it oantal dagen yn it eksperimint. It ferminderjen fan it ferwaarme folume hâldt ek alle omlizzende optyske komponinten fan 'e mikroskoop, benammen de objektive lens, op keamertemperatuer, wat in grut probleem west hat foar de mienskip oant no ta. LA-HTM kin brûkt wurde mei elke lens, ynklusyf oalje immersion linzen, en sil bliuwe by keamertemperatuer sels mei ekstreme temperatueren yn it sichtfjild. De wichtichste beheining fan 'e laserferwaarmingmetoade dy't wy yn dizze stúdzje rapportearje is dat sellen dy't net oanhingje of driuwe fier fan it sichtfjild wêze kinne en dreech te studearjen. In oplossing kin wêze om lenzen mei lege fergrutting te brûken om in gruttere temperatuerferheging fan mear dan in pear hûndert mikrons te berikken. Dizze foarsichtigens wurdt begelaat troch in fermindering fan romtlike resolúsje, mar as it doel is om de beweging fan mikroorganismen te studearjen, is hege romtlike resolúsje net nedich.
De tiidskaal foar ferwaarming (en koeling) fan it systeem \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) hinget ôf fan de grutte, neffens de wet \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), dêr't \ (L\) is de karakteristike grutte fan 'e waarmteboarne (de diameter fan' e laserstraal yn ús stúdzje is \(L\ sawat 100\) μm), \(D\) is de thermyske diffusiviteit fan 'e omjouwing (gemiddelde yn ús gefal, glês en wetter Diffusion rate\(D\ likernôch 2\fold {10}^{-7}\) m2/s Dêrom, yn dizze stúdzje, tiid antwurden fan de folchoarder fan 50 ms, dat wol sizze, quasi-instantaneous). temperatuer feroarings, kin wurde ferwachte Dit instantaneous oprjochting fan temperatuer stiging net allinnich ferkoarte de doer fan it eksperimint, mar ek makket it mooglik presys timing \(t=0\) foar eltse dynamyske stúdzje fan temperatuer effekten.
Us foarstelde metoade is fan tapassing op elk ljocht-absorberend substraat (bygelyks kommersjele samples mei ITO-coating). Gouden nanopartikels binne lykwols by steat om hege absorption te leverjen yn it ynfraread en lege absorption yn it sichtbere berik, wêrfan de lêste skaaimerken fan belang binne foar effektive optyske observaasje yn it sichtbere berik, benammen by it brûken fan fluoreszinsje. Dêrnjonken is goud biokompatibel, gemysk inert, optyske tichtens kin oanpast wurde fan 530 nm nei tichtby ynfraread, en sample tarieding is ienfâldich en ekonomysk29.
Transverse grating wavefront mikroskopy (CGM) lit net allinnich temperatuer mapping op de mikroskaal, mar ek biomassa monitoring, wêrtroch't it benammen brûkber (as net nedich) yn kombinaasje mei LA-HTM. Yn 'e ôfrûne desennia binne oare temperatuermikroskopietechniken ûntwikkele, fral op it mêd fan bioimaging, en de measten fan harren fereaskje it gebrûk fan temperatuergefoelige fluorescerende probes54,55. Dizze metoaden binne lykwols bekritisearre en guon rapporten hawwe unrealistyske temperatuerferoaringen binnen sellen mjitten, mooglik troch it feit dat fluoreszinsje hinget fan in protte oare faktoaren as temperatuer. Dêrnjonken binne de measte fluorescentprobes ynstabyl by hege temperatueren. Dêrom fertsjintwurdigje QPM en benammen CGM in ideale temperatuermikroskopietechnyk foar it bestudearjen fan it libben by hege temperatueren mei optyske mikroskopy.
Stúdzjes fan S. shibatae, dy't optimaal libje by 80 ° C, litte sjen dat LA-HTM tapast wurde kin om hypertermofilen te studearjen, net allinich ienfâldige thermofilen. Yn prinsipe is d'r gjin limyt foar it berik fan temperatueren dat kin wurde berikt mei LA-HTM, en sels temperatueren boppe 100 ° C kinne wurde berikt by atmosfearyske druk sûnder siedend, lykas oantoand troch ús groep fan 38 yn hydrothermyske chemie-applikaasjes by atmosfearyske druk A. In laser wurdt brûkt foar ferwaarming gouden nanoparticles 40 op deselde wize. Sa hat LA-HTM it potensjeel om te wurde brûkt om ungewoane hyperthermophilen te observearjen mei standert optyske mikroskopy mei hege resolúsje ûnder standertbetingsten (dus ûnder miljeu-stress).
Alle eksperiminten waarden útfierd mei help fan in selsmakke mikroskoop, ynklusyf Köhler ferljochting (mei LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), specimen holder mei hânmjittich xy beweging, doelstellings (Olympus, 60x, 0.7 NA, lucht, LUCPlanFLN60X of 60x, Oil 1.25NA , UPLFLN60XOI), CGM-kamera (QLSI-krúsrooster, 39 µm pitch, 0,87 mm fan Andor Zyla-kamerasensor) om yntensiteit en wavefront-ôfbylding te leverjen, en sCMOS-kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bit modus, fan Hamamatsu) om de opname op te nimmen gegevens werjûn yn figuer 5 (bacterial swimmen). De dichroyske beamsplitter is in 749 nm BrightLine râne (Semrock, FF749-SDi01). It filter op 'e foarkant fan' e kamera is in 694 koarte passfilter (FF02-694 / SP-25, Semrock). Titanium saffier laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumped tsunami laser holte, Spectra-Physics yn figuer 2-5, fierder ferfongen troch Millenia laser, Spectraphysics 10 W, pumped Mira laser holte, gearhingjend, foar Fig. -5). 6 en 7) binne ynsteld op de golflingte \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, wat oerienkomt mei it plasmonresonânsjespektrum fan gouden nanopartikels Romtlike ljochtmodulators (1920 × 1152 piksels) waarden kocht fan Meadowlark Optics.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) is in optyske mikroskopy technyk basearre op it kombinearjen fan in twadiminsjonale diffraksjonsgitter (ek bekend as cross grating) op in ôfstân fan ien millimeter fan in konvinsjonele kamera syn sensor. De meast foarkommende foarbyld fan in CGM dat wy hawwe brûkt yn dizze stúdzje wurdt neamd in fjouwer-golflingte transverse shift interferometer (QLSI), dêr't de cross-grating bestiet út in yntinsiteit / faze checkerboard patroan yntrodusearre en patintearre troch Primot et al. yn 200034. De fertikale en horizontale grating linen meitsje grid-lykas skaden op de sensor, de ferfoarming fan dat kin wurde numerike ferwurke yn it echt tiid te krijen de optyske wavefront ferfoarming (of lykweardich faze profyl) fan it ynfallende ljocht. As brûkt op in mikroskoop, kin in CGM-kamera it optyske paadferskil fan in ôfbylde foarwerp werjaan, ek wol bekend as optyske djipte (OT), mei in gefoelichheid yn 'e oarder fan nanometers36. Yn elke CGM-mjitting, om alle defekten yn 'e optyske komponinten as balken te eliminearjen, moat in primêre referinsje OT-ôfbylding wurde nommen en subtrahearre fan alle folgjende ôfbyldings.
Temperatuermikroskopie waard útfierd mei in CGM-kamera lykas beskreaun yn 'e referinsje. 32. Koartsein, ferwaarming fan in floeistof feroaret syn brekingsyndeks, it meitsjen fan in termyske lens effekt dat fersteurt de ynfallende beam. Dizze wavefront-ferfoarming wurdt mjitten troch de CGM en ferwurke mei in dekonvolúsjealgoritme om in trijediminsjonale temperatuerferdieling yn it floeibere medium te krijen. As de gouden nanopartikels lykwichtich ferspraat binne oer de stekproef, kin temperatuermapping dien wurde yn baktearjefrije gebieten om bettere bylden te produsearjen, wat wy soms dogge. It referinsje CGM-ôfbylding waard sûnder ferwaarming oannommen (mei de laser út) en dêrnei fêstlein op deselde lokaasje yn 'e ôfbylding mei de laser oan.
Drye massa mjitting wurdt berikt mei deselde CGM kamera brûkt foar temperatuer imaging. CGM-referinsjeôfbyldings waarden krigen troch it stekproef rap yn x en y te ferpleatsen tidens eksposysje as in middel om elke inhomogeniteit yn 'e OT te gemiddelden troch de oanwêzigens fan baktearjes. Fan OT-ôfbyldings fan baktearjes waard har biomassa krigen mei in ensemble fan ôfbyldings oer gebieten selekteare mei Matlab's selsmakke segmentaasjealgoritme (sjoch subseksje "Numerike koade"), nei de proseduere beskreaun yn ref. 48. Koartsein brûke wy de relaasje \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), wêrby't \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) de optyske djipteôfbylding is, \(m\) is it droege gewicht en \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) is in konstante. Wy hawwe keazen foar \({{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg, wat in typyske konstante is foar libbene sellen.
In cover slip 25 mm yn diameter en 150 µm dik bedekt mei gouden nanopartikels waard pleatst yn in AttofluorTM keamer (Thermofisher) mei de gouden nanopartikels nei boppen. Geobacillus stearothermophilus waard oernachtich yn LB-medium (200 rpm, 60 ° C) foar elke dei fan eksperiminten precultured. In drip fan 5 µl fan in ophinging fan G. stearothermophilus mei in optyske tichtens (OD) fan 0,3 oant 0,5 waard pleatst op in deksel slip mei gouden nanopartikels. Dêrnei waard in rûne deksel slip 18 mm yn diameter mei in gat 5 mm yn diameter yn it sintrum fallen op 'e drip, en 5 μl fan baktearjele suspensie mei deselde optyske tichtens waard kearen tapast oan it sintrum fan it gat. De putten op coverslips waarden taret yn oerienstimming mei de proseduere beskreaun yn ref. 45 (sjoch Oanfoljende ynformaasje foar mear ynformaasje). Foegje dan 1 ml LB-medium ta oan 'e deksel om foar te kommen dat de floeibere laach útdroeget. De lêste deksel wurdt pleatst oer it sletten lid fan 'e Attofluor ™ keamer om ferdamping fan it medium by ynkubaasje te foarkommen. Foar kiemingseksperiminten brûkten wy sporen, dy't, nei konvinsjonele eksperiminten, soms de boppeste deksel bedekken. In ferlykbere metoade waard brûkt om Sulfolobus shibatae te krijen. Trije dagen (200 rpm, 75 ° C) fan foarriedige kultivaasje fan Thiobacillus serrata waarden útfierd yn medium 182 (DSMZ).
Samples fan gouden nanopartikels waarden taret troch micellêre blok copolymer litografy. Dit proses wurdt yn detail beskreaun yn haadstik. 60. Koartsein waarden micellen dy't gouden ionen ynkapsele, synthesisearre troch it mingjen fan it kopolymer mei HAuCl4 yn toluene. De skjinmakke deksels waarden doe ûnderdompele yn 'e oplossing en behannele mei UV-bestraling yn' e oanwêzigens fan in reduksjemiddel om gouden sieden te krijen. Uteinlik waarden gouden sieden groeid troch kontakt te meitsjen mei in deksel mei in wetterige oplossing fan KAuCl4 en ethanolamine foar 16 minuten, wat resultearre yn in kwasy-periodike en heul unifoarme arranzjemint fan net-sfearyske gouden nanopartikels yn it tichtby ynfraread.
Om de interferograms te konvertearjen nei OT-ôfbyldings, hawwe wy in selsmakke algoritme brûkt, lykas detaillearre yn 'e keppeling. 33 en is beskikber as in Matlab-pakket yn it folgjende iepenbiere repository: https://github.com/baffou/CGMprocess. It pakket kin yntinsiteit en OT-ôfbyldings berekkenje basearre op opnommen interferograms (ynklusyf referinsjeôfbyldings) en kamera-arrayôfstannen.
Om it fazepatroan te berekkenjen dat is tapast op SLM om in opjûn temperatuerprofyl te krijen, hawwe wy in earder ûntwikkele selsmakke algoritme39,42 brûkt dat beskikber is yn it folgjende iepenbiere repository: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. De ynfier is it winske temperatuerfjild, dat digitaal of fia in monochrome bmp-ôfbylding ynsteld wurde kin.
Om de sellen te segmentearjen en har droege gewicht te mjitten, brûkten wy ús Matlab-algoritme publisearre yn it folgjende iepenbiere repository: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Op elke ôfbylding moat de brûker klikke op 'e baktearje of mCFU fan belang, de gefoelichheid fan' e wand oanpasse en de seleksje befêstigje.
Foar mear ynformaasje oer stúdzjeûntwerp, sjoch it Nature Research Report abstract keppele oan dit artikel.
Gegevens dy't de resultaten fan dizze stúdzje stypje, binne beskikber fan 'e respektivelike auteurs op ridlik fersyk.
De boarnekoade brûkt yn dizze stúdzje is detaillearre yn 'e seksje Metoaden, en debug-ferzjes kinne wurde downloade fan https://github.com/baffou/ yn' e folgjende repositories: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, en CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. en Sharma, AK. Oersjoch fan thermofilen en har brede tapassing. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D., & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. en Sharma AK In djip begryp fan thermophiles en in breed oanbod fan tapassingen.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Post tiid: Sep-26-2022