De sykte fan Alzheimer (AD) mist proteïnebiomarkers dy't har meardere ûnderlizzende patofysiology wjerspegelje, wat de fuortgong fan diagnoaze en behanneling hinderet. Hjir brûke wy wiidweidige proteomika om cerebrospinale floeistof (CSF) biomarkers te identifisearjen dy't in breed oanbod fan AD-pathofysiology fertsjintwurdigje. Multiplex massaspektrometry identifisearre sawat 3.500 en sawat 12.000 aaiwiten yn AD CSF en it harsens, respektivelik. De netwurkanalyse fan it harsensproteoom besleat 44 biodiversiteitsmodules, wêrfan 15 oerlappe mei it cerebrospinale floeistofproteoom. De CSF AD-markers yn dizze oerlappende modules wurde fold yn fiif proteïnegroepen, dy't ferskate pathofysiologyske prosessen fertsjintwurdigje. De synapses en metabolites yn it AD-harsens ferminderje, mar de CSF nimt ta, wylst de glial-rike myelinaasje en ymmúngroepen yn 'e harsens en CSF ferheegje. De konsistinsje en syktespesifisiteit fan 'e panielwizigingen waarden befêstige yn mear dan 500 ekstra CSF-samples. Dizze groepen identifisearre ek biologyske subgroepen yn asymptomatyske AD. Oer it algemien binne dizze resultaten in belofte stap nei web-basearre biomarker-ark foar klinyske tapassingen yn AD.
De sykte fan Alzheimer (AD) is de meast foarkommende oarsaak fan neurodegenerative demintens wrâldwiid en wurdt karakterisearre troch in breed oanbod fan biologyske systeemdysfunksjes, ynklusyf synaptyske oerdracht, glia-bemiddele immuniteit, en mitochondriale metabolisme (1-3). Syn fêststelde proteïnebiomarkers rjochtsje har lykwols noch altyd op it opspoaren fan amyloïde- en tau-proteïne, en kinne dêrom dizze ferskate pathofysiology net reflektearje. Dizze "kearn" proteïnebiomarkers dy't meast betrouber wurde mjitten yn cerebrospinale floeistof (CSF) omfetsje (i) amyloid beta peptide 1-42 (Aβ1-42), dy't de formaasje fan kortikale amyloïde plaques reflektearret; (ii) totale tau, in teken fan aksondegeneraasje; (iii) phospho-tau (p-tau), in fertsjintwurdiger fan patologyske tau hyperfosforylaasje (4-7). Hoewol dizze biomarkers foar cerebrospinale floeistof ús detectie fan "markearre" AD-proteinsykten (4-7) sterk fasilitearre hawwe, fertsjintwurdigje se mar in lyts part fan 'e komplekse biology efter de sykte.
It ûntbrekken fan pathofysiologyske ferskaat fan AD-biomarkers hat laat ta in protte útdagings, ynklusyf (i) it ûnfermogen om de biologyske heterogeniteit fan AD-pasjinten te identifisearjen en te kwantifisearjen, (ii) ûnfoldwaande mjitting fan 'e earnst en foarútgong fan' e sykte, benammen yn 'e preklinyske faze, En ( iii) de ûntwikkeling fan terapeutyske medisinen dy't net slagge om folslein oplosse alle aspekten fan neurologyske efterútgong. Us ôfhinklikens fan landmarkpatology om AD te beskriuwen fan besibbe sykten fergruttet dizze problemen allinich. Hieltyd mear bewiis litte sjen dat de measte âlderein mei demintens mear as ien patologysk karakteristyk fan kognitive ferfal hawwe (8). Safolle as 90% of mear fan yndividuen mei AD-patology hawwe ek vaskulêre sykte, TDP-43-ynklúzjes, of oare degenerative sykten (9). Dizze hege proporsjes fan patologyske oerlap hawwe ús hjoeddeistige diagnostyske ramt foar demintens fersteurd, en in wiidweidigere pathofysiologyske definysje fan 'e sykte is nedich.
Mei it each op de driuwende needsaak foar in ferskaat oan AD biomarkers, it fjild wurdt hieltyd mear oannimme de "omics" metoade basearre op it totale systeem te ûntdekken biomarkers. De Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP) -AD Alliance waard lansearre yn 2014 en stiet oan 'e foargrûn fan it programma. Dizze multydissiplinêre ynspanning troch de National Institutes of Health, academia, en yndustry hat as doel om systeem-basearre strategyen te brûken om de patofysiology fan AD better te definiearjen en biodiversiteit diagnostyske analyze en behannelingstrategyen te ûntwikkeljen (10). As ûnderdiel fan dit projekt, netwurk proteomics is wurden in belofte ark foar de foarútgong fan systeem-basearre biomarkers yn AD. Dizze unbiased data-oandreaune oanpak organisearret komplekse proteomika-gegevenssets yn groepen as "modules" fan ko-útdrukte aaiwiten dy't ferbûn binne mei spesifike seltypen, organellen en biologyske funksjes (11-13). Hast 12 ynformaasje-rike netwurk proteomics-stúdzjes binne útfierd op it AD-harsens (13-23). Yn 't algemien jouwe dizze analyzes oan dat it AD-brain-netwurkproteom in tige bewarre modulêre organisaasje ûnderhâldt yn ûnôfhinklike kohorten en meardere kortikale regio's. Derneist litte guon fan dizze modules reprodusearjende feroaringen sjen yn AD-relatearre oerfloed oer datasets, wat de patofysiology fan meardere sykten reflektearret. Mei-elkoar litte dizze befiningen in belofte ankerpunt sjen foar de ûntdekking fan it harsensnetwurkproteoom as in systeem-basearre biomarker yn AD.
Om it AD-harsensnetwurkproteoom te transformearjen yn klinysk brûkbere systeem-basearre biomarkers, kombineare wy it brain-ôflaat netwurk mei de proteomyske analyze fan AD CSF. Dizze yntegreare oanpak late ta de identifikaasje fan fiif tasizzende sets fan CSF-biomarkers dy't ferbûn binne mei in breed oanbod fan harsens-basearre pathophysiology, ynklusyf synapses, bloedfetten, myelinaasje, ûntstekking en dysfunksje fan metabolike paden. Wy validearre dizze biomarkerpanielen mei súkses troch meardere replikaasje-analyzes, ynklusyf mear dan 500 CSF-samples fan ferskate neurodegenerative sykten. Dizze validaasje-analyzes omfetsje it ûndersiikjen fan groepdoelen yn 'e CSF fan pasjinten mei asymptomatyske AD (AsymAD) of it sjen litte fan bewiis fan abnormale amyloïde-akkumulaasje yn in normale kognitive omjouwing. Dizze analyzes markearje de signifikante biologyske heterogeniteit yn 'e AsymAD-befolking en identifisearje panielmarkers dy't mooglik yndividuen yn' e ierste stadia fan 'e sykte kinne subtype. Oer it algemien fertsjinwurdigje dizze resultaten in wichtige stap yn 'e ûntwikkeling fan ark foar proteïnebiomarker basearre op meardere systemen dy't in protte fan' e klinyske útdagings mei AD mei súkses kinne oplosse.
It haaddoel fan dizze stúdzje is om nije cerebrospinale floeistof biomarkers te identifisearjen dy't ferskate harsens-basearre patofysiology reflektearje dy't liede ta AD. Figure S1 sketst ús ûndersyksmetoadyk, dy't omfettet (i) in wiidweidige analyse dreaun troch foarriedige befiningen fan AD CSF en it netwurk harsens proteoom om meardere harsens-relatearre CSF-sykte biomarkers te identifisearjen, en (ii) folgjende replikaasje Dizze biomarkers binne yn ferskate ûnôfhinklike cerebrospinal fluid kohorten. It ûntdekkingsrjochte ûndersyk begon mei de analyze fan 'e differinsjaal ekspresje fan CSF yn 20 kognitive normale persoanen en 20 AD-pasjinten by Emory Goizueta Alzheimer's Disease Research Center (ADRC). De diagnoaze fan AD wurdt definiearre as in signifikante kognitive beheining yn 'e oanwêzigens fan leech Aβ1-42 en ferhege nivo's fan totale tau en p-tau yn' e cerebrospinale floeistof [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabel S1A). De kontrôle (gemiddelde MoCA, 26.7 ± 2.2) hie normale nivo's fan CSF-biomarkers.
Human CSF is karakterisearre troch in dynamysk oanbod fan proteïne oerfloed, wêryn albumine en oare ekstreem oerfloedige proteïnen de deteksje fan proteïnen fan belang kinne foarkomme (24). Om de djipte fan 'e ûntdekking fan proteïnen te fergrutsjen, hawwe wy de earste 14 heul oerfloedige proteïnen fan elke CSF-monster fuortsmiten foardat massaspektrometry (MS) analyse (24). In totaal fan 39.805 peptiden waarden identifisearre troch MS, dy't yn kaart brocht waarden oan 3691 proteomen yn 40 samples. Protein kwantifikaasje wurdt útfierd troch meardere tandem massa tag (TMT) labeling (18, 25). Om de ûntbrekkende gegevens op te lossen, hawwe wy allinich de proteïnen opnommen dy't yn op syn minst 50% fan 'e samples yn' e folgjende analyse waarden kwantifisearre, en dus úteinlik 2875 proteomen kwantifisearje. Troch it signifikante ferskil yn 'e totale nivo's fan' e oerfloed fan proteïne, waard in kontrôleprobe statistysk beskôge as in útslach (13) en waard net opnommen yn 'e folgjende analyze. De oerfloedwearden fan 'e oerbleaune 39 samples waarden oanpast neffens leeftyd, geslacht, en batch-kovariânsje (13-15, 17, 18, 20, 26).
Mei it brûken fan statistyske t-testanalyse om differinsjaal ekspresje te evaluearjen op 'e regressiongegevensset, identifisearre dizze analyse proteïnen wêrfan de oerfloednivo's signifikant feroare waarden (P <0.05) tusken de kontrôle en AD-gefallen (Tabel S2A). Lykas werjûn yn figuer 1A, waard de oerfloed fan in totaal fan 225-proteins yn AD signifikant fermindere, en de oerfloed fan 303-proteins waard signifikant ferhege. Dizze differinsjaal útdrukte aaiwiten omfetsje ferskate earder identifisearre serebrospinale floeistof AD-markers, lykas mikrotubule-assosjearre proteïne tau (MAPT; P = 3.52 × 10-8), neurofilament (NEFL; P = 6.56 × 10-3), groei-relatearre Protein 43 (GAP43; P = 1.46 × 10-5), Fatty Acid Binding Protein 3 (FABP3; P = 2.00 × 10-5), Chitinase 3 lykas 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10-6), Neural Granulin (NRGN; P = 3.43 × 10-4) en VGF nerve groeifaktor (VGF; P = 4.83 × 10-3) (4-6). Wy hawwe lykwols ek oare tige wichtige doelen identifisearre, lykas GDP-dissociaasje-ynhibitor 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) en SPARC-relatearre modulêre kalsiumbinding 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). Gene Ontology (GO) analyse fan 225 signifikant fermindere aaiwiten die bliken nauwe ferbiningen mei lichemsfluidprosessen lykas steroid metabolisme, bloedkoagulaasje en hormoanaktiviteit (figuer 1B en tabel S2B). Yn tsjinstelling is it signifikant ferhege proteïne fan 303 nau besibbe oan selstruktuer en enerzjymetabolisme.
(A) It fulkaanplot toant de log2-foldwiziging (x-as) relatyf oan de -log10 statistyske P-wearde (y-as) krigen troch de t-test, dy't brûkt wurdt om differinsjaal ekspresje te detektearjen tusken de kontrôle (CT) en AD-gefallen fan it CSF-proteoom fan alle aaiwiten. Proteins mei signifikant fermindere nivo's (P <0.05) yn AD wurde yn blau werjûn, wylst proteïnen mei signifikant ferhege nivo's yn sykte yn read wurde werjûn. It selekteare proteïne wurdt markearre. (B) De top GO-termen yn ferbân mei proteïne wurde signifikant fermindere (blau) en ferhege (read) yn AD. Toant de trije GO-termen mei de heechste z-scores op it mêd fan biologyske prosessen, molekulêre funksjes en sellulêre komponinten. (C) MS mjitten MAPT nivo yn CSF stekproef (lofts) en syn korrelaasje mei sample ELISA tau nivo (rjochts). De Pearson-korrelaasjekoëffisjint mei de relevante P-wearde wurdt werjûn. Fanwegen it gebrek oan ELISA-gegevens foar ien AD-gefal, omfetsje dizze sifers wearden foar 38 fan 'e 39 analysearre gefallen. (D) Begeliede klusteranalyse (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) oanpast P <0.01) op 'e kontrôle en AD CSF fûn samples mei de 65 meast signifikant feroare proteïnen yn' e dataset. Standardisearje, normalisearje.
It proteomyske nivo fan MAPT is nau besibbe oan it selsstannich mjitten ELISA tau-nivo (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; figuer 1C), it stypjen fan de jildigens fan ús MS-mjitting. Nei trypsindigestion op it nivo fan amyloïde foarrinnerprotein (APP), kinne de isoform-spesifike peptiden yn kaart brocht wurde oan 'e C-terminus fan Aβ1-40 en Aβ1-42 kinne net effisjint ionisearre wurde (27, 28). Dêrom hawwe de APP-peptiden dy't wy identifisearre hawwe neat te meitsjen mei ELISA Aβ1-42-nivo's. Om de differinsjaal ekspresje fan elk gefal te evaluearjen, brûkten wy differinsjaal útdrukte aaiwiten mei P <0.0001 [falske ûntdekkingsrate (FDR) korrizjearre P <0.01] om in begeliedende klusteranalyze fan 'e samples út te fieren (Tabel S2A). Lykas werjûn yn figuer 1D, kinne dizze 65 heul wichtige aaiwiten samples korrekt klusterje neffens syktestatus, útsein ien AD-gefal mei kontrôle-like skaaimerken. Fan dizze 65 aaiwiten, 63 tanommen yn AD, wylst mar twa (CD74 en ISLR) fermindere. Yn totaal hawwe dizze cerebrospinale floeistofanalyses hûnderten aaiwiten yn AD identifisearre dy't as sykte biomarkers kinne tsjinje.
Dêrnei hawwe wy in ûnôfhinklike netwurkanalyse útfierd fan it AD-harsensproteoom. De harsenskohort fan dizze ûntdekking omfette dorsolaterale prefrontale cortex (DLPFC) fan kontrôle (n = 10), sykte fan Parkinson (PD; n = 10), mingde AD / PD (n = 10) en AD (n = 10) gefallen. ) Foarbyld. Emery Goizueta ADRC. De demografy fan dizze 40 gefallen binne earder beskreaun (25) en wurde gearfette yn Tabel S1B. Wy brûkten TMT-MS om dizze 40 harsensweefsels te analysearjen en de replikaasjekohort fan 27 gefallen. Yn totaal produsearren dizze twa brain-datasets 227,121 unike peptiden, dy't yn kaart brocht waarden oan 12,943 proteomen (25). Allinich dy aaiwiten dy't yn op syn minst 50% fan 'e gefallen waarden kwantifisearre waarden opnommen yn folgjende ûndersiken. De definitive ûntdekkingsgegevensset befettet 8817 kwantifisearre aaiwiten. Oanpasse nivo's fan proteïne oerfloed op basis fan leeftyd, geslacht, en post-mortem ynterval (PMI). De differinsjaal ekspresje-analyze fan 'e gegevensset nei regression liet sjen dat> 2000 proteïnenivo's signifikant feroare waarden [P <0.05, analyze fan fariânsje (ANOVA)] yn twa of mear syktekohieren. Dêrnei hawwe wy in begeliede klusteranalyze útfierd op basis fan de differinsjaal útdrukte aaiwiten, en P <0.0001 yn AD / kontrôle en / of AD / PD fergelikingen (figuer S2, A en B, Tabel S2C). Dizze 165 tige feroare proteïnen jouwe dúdlik gefallen mei AD-patology út 'e kontrôle- en PD-samples, befêstigje de sterke AD-spesifike feroaringen yn it heule proteoom.
Wy brûkten doe in algoritme neamd Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) om netwurkanalyse út te fieren op it ûntdutsen harsensproteoom, dat de gegevensset organisearret yn proteïnemodules mei ferlykbere ekspresjepatroanen (11-13). De analyze identifisearre 44 modules (M) co-útdrukte aaiwiten, sortearre en nûmere fan de grutste (M1, n = 1821 aaiwiten) nei de lytste (M44, n = 34 aaiwiten) (figuer 2A en Tabel S2D)). Lykas hjirboppe neamd (13) Berekkenje it represintative ekspresjeprofyl as karakteristike proteïne fan elke module, en korrelearje it mei de syktestân en AD-patology, dat is, it alliânsje fan Alzheimer's Disease Registry (CERAD) en Braak Score (figuer 2B) fêstigje. Yn 't algemien wiene 17-modules signifikant relatearre oan AD neuropathology (P <0.05). In protte fan dizze sykte-relatearre modules binne ek ryk yn sel type-spesifike markers (figuer 2B). Lykas hjirboppe neamd (13), wurdt seltypeferriking bepaald troch it analysearjen fan de module-oerlap en de referinsjelist fan seltype-spesifike genen. Dizze genen binne ôflaat fan publisearre gegevens yn isolearre mûzenuronen, endotheliale en gliale sellen. RNA-sequencing (RNA-seq) eksperimint (29).
(A) Untdek de WGCNA fan it harsensproteoom. (B) Biweight midcorrelation (BiCor) analyze fan it modulêre hantekeningprotein (it earste grutte komponint fan modulêre proteïne-ekspresje) mei AD neuropatologyske skaaimerken (boppe), ynklusyf CERAD (Aβ plaque) en Braak (tau tangles) skoares. De yntinsiteiten fan positive (read) en negative (blau) korrelaasjes wurde werjûn troch in twa-kleurige waarmtekaart, en asterisken jouwe statistyske betsjutting oan (P <0.05). Brûk Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (ûnder) om de seltypeferiening fan elke proteïnemodule te beoardieljen. De yntinsiteit fan 'e reade skaden jout de mjitte fan ferriking fan seltype oan, en de asterisk jout statistyske betsjutting oan (P <0.05). Brûk de BH-metoade om de P-wearde te korrigearjen ôflaat fan 'e FET. (C) GO analyze fan modulêre aaiwiten. De meast besibbe biologyske prosessen wurde werjûn foar elke module of besibbe modulegroep. oligo, oligodendrocyte.
In set fan fiif nau besibbe astrozyten en mikroglia-rike modules (M30, M29, M18, M24, en M5) toande in sterke positive korrelaasje mei AD neuropathology (figuer 2B). Ontology-analyze ferbynt dizze gliale modules mei selgroei, proliferaasje en immuniteit (figuer 2C en tabel S2E). Twa ekstra gliale modules, M8 en M22, wurde ek sterk opregulearre yn sykte. M8 is tige besibbe oan it Toll-like reseptorpaad, in sinjaalkaskade dy't in wichtige rol spilet yn 'e oanberne ymmúnreaksje (30). Tagelyk is M22 nau besibbe oan post-translational modifikaasje. M2, dy't ryk is yn oligodendrozyten, toant in sterke positive korrelaasje mei AD-patology en in ontologyske ferbining mei nukleosidesynthese en DNA-replikaasje, wat oanjout op fersterke selproliferaasje yn sykten. Oer it algemien stypje dizze befiningen de hichte fan gliale modules dy't wy earder hawwe waarnommen yn it AD-netwurkproteoom (13, 17). It is op it stuit fûn dat in protte AD-relatearre gliale modules yn it netwurk legere ekspresjenivo's sjen litte yn kontrôle- en PD-gefallen, en markearje har syktespesifisiteit dy't ferhege is yn AD (figuer S2C).
Allinich fjouwer modules yn ús netwurkproteom (M1, M3, M10, en M32) binne sterk negatyf korrelearre mei AD-patology (P <0.05) (figuer 2, B en C). Sawol M1 as M3 binne ryk oan neuronale markers. M1 is tige besibbe oan synaptyske sinjalen, wylst M3 nau besibbe is oan mitochondriale funksje. D'r is gjin bewiis foar ferriking fan seltype foar M10 en M32. M32 wjerspegelet de ferbining tusken M3 en sel metabolisme, wylst M10 is tige besibbe oan sel groei en microtubule funksje. Yn ferliking mei AD wurde alle fjouwer modules ferhege yn kontrôle en PD, wêrtroch't se sykte-spesifike AD-wizigingen jouwe (figuer S2C). Oer it algemien stypje dizze resultaten de fermindere oerfloed fan neuron-rike modules dy't wy earder hawwe waarnommen yn AD (13, 17). Gearfetsjend produsearre de netwurkanalyse fan it harsensproteoom dat wy ûntdutsen AD-spesifyk feroare modules yn oerienstimming mei ús eardere befinings.
AD wurdt karakterisearre troch in betide asymptomatyske poadium (AsymAD), wêryn persoanen amyloïde-akkumulaasje eksposearje sûnder klinyske kognitive ferfal (5, 31). Dit asymptomatyske poadium fertsjintwurdiget in kritysk finster foar iere deteksje en yntervinsje. Wy hawwe earder sterke modulêre behâld fan AsymAD- en AD-brain-netwurkproteomen oantoand oer unôfhinklike datasets (13, 17). Om derfoar te soargjen dat it harsenetwurk dat wy op it stuit ûntdutsen is yn oerienstimming mei dizze eardere befiningen, analysearren wy it behâld fan 44-modules yn 'e replike gegevensset fan 27 DLPFC-organisaasjes. Dizze organisaasjes omfetsje kontrôle (n = 10), AsymAD (n = 8) en AD (n = 9) gefallen. Kontrôle- en AD-samples waarden opnommen yn 'e analyze fan ús ûntdekkingsbrain-kohort (Tabel S1B), wylst AsymAD-gefallen allinich unyk wiene yn' e replikaasjekohort. Dizze AsymAD-gefallen kamen ek fan 'e Emory Goizueta ADRC-breinbank. Hoewol de kognysje normaal wie op 'e tiid fan' e dea, wiene amyloïdenivo's abnormaal heech (gemiddelde CERAD, 2.8 ± 0.5) (Tabel S1B).
TMT-MS-analyse fan dizze 27 harsensweefsels resultearre yn 'e kwantifikaasje fan 11,244 proteomen. Dizze definitive tel omfettet allinich dy aaiwiten kwantifisearre yn op syn minst 50% fan 'e samples. Dizze replikearre gegevensset befettet 8638 (98.0%) fan 'e 8817 aaiwiten ûntdutsen yn ús ûntdekking fan harsensanalyse, en hat hast 3000 signifikant feroare proteïnen tusken de kontrôle- en AD-kohieren (P <0.05, nei Tukey's keppele t-test foar analyse fan fariânsje) ( Tabel S2F). Under dizze differinsjaal útdrukte aaiwiten liet 910 ek signifikante nivoferoarings sjen tusken AD en harsensproteomkontrôlefallen (P <0.05, nei ANOVA Tukey-paar t-test). It is de muoite wurdich op te merken dat dizze 910-markers tige konsekwint binne yn 'e rjochting fan feroaring tusken proteomen (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (figuer S3A). Under de ferhege proteïnen binne de proteïnen mei de meast konsekwinte feroaringen tusken datasets benammen leden fan 'e glial-rike M5- en M18-modules (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, en GFAP). Under de fermindere proteïnen wiene dy mei de meast konsekwinte feroaringen hast allinich leden fan 'e M1-module (NPTX2, VGF, en RPH3A) ferbûn mei de synapse. Wy ferifieare fierder de AD-relatearre feroaringen fan midkine (MDK), CD44, sekreteare frizzled-relatearre proteïne 1 (SFRP1) en VGF troch western blotting (figuer S3B). Module-behâldanalyse liet sjen dat sawat 80% fan 'e proteïnemodules (34/44) yn' e harsensproteom signifikant bewarre waarden yn 'e replikaasjegegevensset (z-score> 1.96, FDR korrizjearre P <0.05) (Figure S3C). Fjirtjin fan dizze modules waarden spesjaal reservearre tusken de twa proteomen (z-score> 10, FDR korrizjearre P <1.0 × 10-23). Oer it algemien markeart de ûntdekking en replikaasje fan 'e hege mjitte fan konsistinsje yn differinsjaal ekspresje en modulêre gearstalling tusken it harsensproteoom de reprodusearberens fan' e feroaringen yn AD frontale cortexproteinen. Derneist befêstige it ek dat AsymAD en mear avansearre sykten in heul ferlykbere harsensnetwurkstruktuer hawwe.
In mear detaillearre analyze fan 'e differinsjaal ekspresje yn' e brain-replikaasjegegevens set markearret de signifikante graad fan AsymAD-proteinwizigingen, ynklusyf in totaal fan 151 signifikant feroare proteïnen tusken AsymAD en de kontrôle (P <0.05) (Figure S3D). Yn oerienstimming mei de amyloïde lading, APP yn it harsens fan AsymAD en AD tanommen signifikant. MAPT feroaret allinich signifikant yn AD, wat konsekwint is mei ferhege nivo's fan tangels en har bekende korrelaasje mei kognitive ferfal (5, 7). De glial-rike modules (M5 en M18) wurde tige wjerspegele yn 'e ferhege proteïnen yn AsymAD, wylst de neuron-relatearre M1-module de meast represintatyf is fan' e fermindere proteïnen yn AsymAD. In protte fan dizze AsymAD-markers litte gruttere feroaringen sjen yn symptomatyske sykten. Under dizze markers is SMOC1, in gliaprotein dat heart ta M18, dat is ferbûn mei harsentumors en de ûntwikkeling fan eagen en ledematen (32). MDK is in heparine-binende groeifaktor yn ferbân mei selgroei en angiogenesis (33), in oar lid fan M18. Yn ferliking mei de kontrôtgroep fergrutte AsymAD signifikant, folge troch in gruttere ferheging fan AD. Yn tsjinstelling waard it synaptyske proteïne neuropentraxin 2 (NPTX2) signifikant fermindere yn it AsymAD-harsens. NPTX2 wie earder ferbûn mei neurodegeneraasje en hat in erkende rol yn it bemiddeljen fan eksitative synapses (34). Oer it algemien litte dizze resultaten in ferskaat oan ferskillende preklinyske proteïnewizigingen yn AD sjen dy't lykje foarút te gean mei de earnst fan 'e sykte.
Sjoen dat wy in signifikante djipte fan proteïnedekking hawwe berikt yn 'e ûntdekking fan it harsensproteoom, besykje wy de oerlaap folsleiner te begripen mei it AD-transkriptoom op netwurknivo. Dêrom fergelike wy it harsensproteoom dat wy ûntdutsen mei de module dy't wy earder genereare út 'e mikroarray-mjitting fan 18,204-genen yn AD (n = 308) en kontrôle (n = 157) DLPFC-weefsels (13). oerlappend. Yn totaal identifisearren wy 20 ferskillende RNA-modules, wêrfan in protte de ferriking fan spesifike seltypen oantoand, ynklusyf neuroanen, oligodendrozyten, astrocyten en mikroglia (figuer 3A). De meardere feroarings fan dizze modules yn AD wurde werjûn yn figuer 3B. Yn oerienstimming mei ús eardere protein-RNA-oerlapanalyse mei it djipper unlabele MS-proteoom (sawat 3000 proteïnen) (13), binne de measte fan 'e 44 modules yn it harsensproteoomnetwurk dat wy fûnen yn it transkriptoomnetwurk. Der is gjin signifikante oerlaap yn. ús ûntdekking en replikaasje fan 'e 34 proteïnemodules dy't tige bewarre wurde yn' e harsensproteom, allinich 14 (~ 40%) passeare Fisher's eksakte test (FET) die bliken in statistysk signifikante oerlaap te hawwen mei it transkriptoom (figuer 3A). Kompatibel mei reparaasje fan DNA-skea (P-M25 en P-M19), proteïne-oersetting (P-M7 en P-M20), RNA-bining / splicing (P-M16 en P-M21) en proteïne-targeting (P-M13 en P- M23) oerlaapet net mei modules yn it transkriptoom. Dêrom, hoewol in djippere proteoomgegevensset wurdt brûkt yn 'e hjoeddeistige oerlapanalyse (13), wurdt it measte fan it AD-netwurkproteoom net yn kaart brocht oan it transkriptoomnetwurk.
(A) Hypergeometryske FET toant de ferriking fan seltype-spesifike markers yn 'e RNA-module fan' e AD-transkriptoom (boppe) en de mjitte fan oerlap tusken de RNA (x-as) en proteïne (y-as) modules fan it AD-harsens (ûnder). De yntinsiteit fan 'e reade skaden jout de mjitte fan ferriking fan seltypen yn' e boppeste paniel en de yntinsiteit fan 'e oerlaap fan' e modules yn 'e ûnderste paniel. Asterisks jouwe statistyske betsjutting oan (P <0.05). (B) De mjitte fan korrelaasje tusken de karakteristike genen fan elke transkriptoommodule en AD-status. De modules oan de linkerkant binne de meast negatyf korrelearre mei AD (blau), en dy oan de rjochterkant binne de meast posityf korrelearre mei AD (read). De log-transformearre BH-korrigearre P-wearde jout de mjitte fan statistyske betsjutting fan elke korrelaasje oan. (C) Signifikante oerlappende modules mei dielde seltype ferriking. (D) Korrelaasje-analyze fan 'e log2-fold feroaring fan it markearre proteïne (x-as) en RNA (y-as) yn 'e oerlappende module. De Pearson-korrelaasjekoëffisjint mei de relevante P-wearde wurdt werjûn. mikro, mikroglia; himellichems, astrocyten. CT, kontrôle.
De measte oerlappende proteïne- en RNA-modules diele ferlykbere seltype-ferrikingsprofilen en konsekwinte AD-feroaringsrjochtingen (figuer 3, B en C). Mei oare wurden, de synapse-relatearre M1-module fan it harsensproteoom (PM1) wurdt yn kaart brocht oan trije neuronaal-rike homologe RNA-modules (R-M1, R-M9 en R-M16), dy't yn AD binne. in fermindere nivo. Lykas, de glial-rike M5 en M18 protein modules oerlaapje mei RNA modules ryk oan astrocytes en microglial markers (R-M3, R-M7, en R-M10) en binne tige belutsen by sykten Ferheging. Dizze dielde modulêre funksjes tusken de twa datasets stypje fierder de ferriking fan seltype en sykte-relatearre feroaringen dy't wy hawwe waarnommen yn it harsensproteoom. Wy observearren lykwols in protte signifikante ferskillen tusken de RNA- en proteïnenivo's fan yndividuele markers yn dizze dielde modules. Korrelaasje-analyse fan 'e differinsjaal ekspresje fan' e proteomika en transkriptomika fan 'e molekulen binnen dizze oerlappende modules (figuer 3D) markeart dizze ynkonsistinsje. Bygelyks, APP en ferskate oare gliale moduleproteinen (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, en SFRP1) lieten in signifikante ferheging fan it AD-proteoom sjen, mar d'r wie hast gjin feroaring yn it AD-transkriptoom. Dizze proteïne-spesifike feroarings kinne nau besibbe wurde oan amyloïde plaques (23, 35), markearje it proteoom as de boarne fan patologyske feroaringen, en dizze wizigingen kinne net reflektearre wurde yn it transkriptoom.
Nei it ûnôfhinklik analysearjen fan 'e harsens en CSF-proteomen dy't wy ûntdutsen, hawwe wy in wiidweidige analyse útfierd fan' e twa datasets om AD CSF-biomarkers te identifisearjen relatearre oan 'e patofysiology fan it harsensetwurk. Wy moatte earst de oerlaap fan 'e twa proteomen definiearje. Hoewol it breed akseptearre is dat CSF neurochemyske feroaringen yn it AD-harsens (4) reflektearret, is de krekte mjitte fan oerlap tusken it AD-harsens en it CSF-proteoom ûndúdlik. Troch it fergelykjen fan it oantal dielde genprodukten ûntdutsen yn ús twa proteomen, fûnen wy dat hast 70% (n = 1936) fan 'e proteïnen identifisearre yn' e cerebrospinale floeistof waarden ek kwantifisearre yn 'e harsens (figuer 4A). De measte fan dizze oerlappende aaiwiten (n = 1721) wurde yn kaart brocht oan ien fan 44 ko-ekspresjemodules út 'e ûntdekkingsbrain-dataset (figuer 4B). Lykas ferwachte, eksposearre de seis grutste harsens modules (M1 oant M6) it grutste bedrach fan CSF oerlaap. Lykwols, der binne lytsere harsens modules (Bygelyks, M15 en M29) dat berikke in ûnferwacht hege graad fan oerlaap, grutter as in harsens module twa kear syn grutte. Dit motivearret ús om in mear detaillearre, statistysk oandreaune metoade oan te nimmen om de oerlap tusken it harsens en cerebrospinale floeistof te berekkenjen.
(A en B) De aaiwiten ûntdutsen yn 'e ûntdekking fan harsens en CSF-gegevenssets oerlappe. De measte fan dizze oerlappende aaiwiten binne assosjearre mei ien fan 'e 44 ko-ekspresje-modules fan it brain-ko-ekspresje-netwurk. (C) Untdek de oerlaap tusken it cerebrospinale floeistofproteom en it brain network proteome. Elke rige fan 'e waarmtekaart stiet foar in aparte oerlapanalyse fan' e hypergeometryske FET. De boppeste rige toant de oerlaap (griis / swart skaden) tusken de harsensmodule en it hiele CSF-proteom. De twadde line toant dat de oerlap tusken harsensmodules en CSF-protein (skaad yn read) signifikant opregulearre wurdt yn AD (P <0.05). De tredde rige lit sjen dat de oerlap tusken harsensmodules en CSF-protein (blauwe skaden) signifikant delregulearre is yn AD (P <0.05). Brûk de BH-metoade om de P-wearde te korrigearjen ôflaat fan 'e FET. (D) Folding module paniel basearre op sel type assosjaasje en besibbe GO termen. Dizze panielen befetsje in totaal fan 271 brain-relatearre proteïnen, dy't betsjuttingsfolle differinsjaal ekspresje hawwe yn it CSF-proteoom.
Mei help fan single-tailed FET's beoardielje wy it belang fan proteïne-oerlap tusken it CSF-proteoom en yndividuele harsensmodules. De analyze die bliken dat in totaal fan 14 harsensmodules yn 'e CSF-gegevensset statistysk signifikante oerlappingen hawwe (FDR oanpast P <0.05), en in ekstra module (M18) wêrfan de oerlap tichtby betsjutting is (FDR oanpast P = 0.06) (Figure 4C) , boppeste rige). Wy binne ek ynteressearre yn modules dy't sterk oerlaapje mei differinsjaal útdrukte CSF-proteinen. Dêrom hawwe wy twa ekstra FET-analyzes tapast om te bepalen hokker fan (i) CSF-proteïne signifikant ferhege waard yn AD en (ii) CSF-proteïne wie signifikant fermindere yn AD (P <0.05, keppele t test AD / kontrôle) Brain-modules mei betsjuttingsfolle oerlap tusken harren. Lykas werjûn yn 'e midden- en ûnderste rigen fan figuer 4C, litte dizze ekstra analyzes sjen dat 8 fan' e 44 harsensmodulen signifikant oerlaapje mei it proteïne tafoege yn AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, en M38) . ), wylst mar twa modules (M6 en M15) in sinfolle oerlaap sjen litte mei it fermindere proteïne yn AD CSF. Lykas ferwachte binne alle 10-modules yn 'e 15-modules mei de heechste oerlaap mei it CSF-proteoom. Dêrom geane wy derfan út dat dizze 15-modules boarnen mei hege opbringst binne fan AD-brain-ôflaat CSF-biomarkers.
Wy folden dizze 15 oerlappende modules yn fiif grutte proteïnepanielen basearre op har tichtby yn it WGCNA-beamdiagram en har assosjaasje mei seltypen en genontology (figuer 4D). It earste paniel befettet modules ryk oan neuronmarkers en synapse-relatearre aaiwiten (M1 en M12). It synaptyske paniel befettet yn totaal 94 proteïnen, en de nivo's yn it CSF-proteom binne signifikant feroare, wêrtroch it de grutste boarne is fan harsens-relatearre CSF-markers ûnder de fiif panielen. De twadde groep (M6 en M15) toande de nauwe ferbining mei endotheliale selmarkers en vaskulêre lichem, lykas "wûne healing" (M6) en "regulaasje fan humorale ymmúnrespons" (M15). M15 is ek tige besibbe oan lipoprotein metabolisme, dat is nau besibbe oan endothelium (36). It vaskulêre paniel befettet 34 CSF-markers relatearre oan it harsens. De tredde groep omfettet modules (M2 en M4) dy't signifikant besibbe binne oan oligodendrozytemarkers en selproliferaasje. Bygelyks, de termen fan ontology op topnivo fan M2 omfetsje "positive regeling fan DNA-replikaasje" en "purine biosyntezeproses". Underwilens omfetsje dy fan M4 "gliale seldifferinsjaasje" en "chromosome segregaasje". It myelinaasjepaniel befettet 49 CSF-markers relatearre oan it harsens.
De fjirde groep befettet de measte modules (M30, M29, M18, M24, en M5), en hast alle modules binne signifikant ryk oan microglia en astrocyte markers. Fergelykber mei it myelinaasjepaniel befettet it fjirde paniel ek modules (M30, M29, en M18) dy't nau besibbe binne oan selproliferaasje. De oare modules yn dizze groep binne tige besibbe oan immunologyske termen, lykas "immune effekt proses" (M5) en "immune antwurd regeling" (M24). De gliale ymmúngroep befettet 42 CSF-markers relatearre oan it harsens. Uteinlik omfettet it lêste paniel 52 brain-relatearre markers op 'e fjouwer modules (M44, M3, M33, en M38), dy't allegear op it lichem binne relatearre oan enerzjy opslach en metabolisme. De grutste fan dizze modules (M3) is nau besibbe oan mitochondria en is ryk oan neuron-spesifike markers. M38 is ien fan 'e lytsere module leden yn dit metabolome en ek toant matige neuron spesifisiteit.
Yn 't algemien reflektearje dizze fiif panielen in breed oanbod fan seltypen en funksjes yn' e AD-cortex, en befetsje kollektyf 271 brain-relatearre CSF-markers (Tabel S2G). Om de jildigens fan dizze MS-resultaten te evaluearjen, brûkten wy de proximity extension assay (PEA), in ortogonale antybody-basearre technology mei multiplexingmooglikheden, hege gefoelichheid en spesifisiteit, en reanalyze de cerebrospinale floeistofmonsters dy't wy fûnen In subset fan dizze 271 biomarkers (n = 36). Dizze 36-doelen litte de feroaring sjen yn it AD-multyft fan PEA, dy't nau besibbe is oan ús MS-basearre befiningen (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), dy't de resultaten fan ús wiidweidige MS-analyze sterk ferifiearre (figuer S4) ).
De biologyske tema's beklamme troch ús fiif groepen, fan synaptyske sinjalearring oant enerzjymetabolisme, binne allegear relatearre oan 'e patogenese fan AD (1-3). Dêrom binne alle 15-modules dy't dizze panielen befetsje relatearre oan 'e AD-patology yn it harsensproteoom dat wy ûntdutsen (figuer 2B). De meast opmerklike is de hege positive patologyske korrelaasje tusken ús gliale modules en de sterke negative patologyske korrelaasje tusken ús grutste neuronale modules (M1 en M3). De differinsjaal ekspresje-analyze fan ús replikearre harsensproteoom (figuer S3D) markearret ek M5- en M18-ôflaat gliale proteïnen. Yn AsymAD en symptomatyske AD, de meast ferhege gliaproteinen en M1-relatearre synapses It proteïne wurdt it meast fermindere. Dizze observaasjes jouwe oan dat de 271 cerebrospinale floeistofmarkers dy't wy yn 'e fiif groepen identifisearre binne relatearre oan sykteprosessen yn' e AD-cortex, ynklusyf dyjingen dy't foarkomme yn 'e iere asymptomatyske stadia.
Om de feroaringsrjochting fan 'e panielproteinen yn' e harsens en spinale floeistof better te analysearjen, tekene wy it folgjende foar elk fan 'e 15 oerlappende modules: (i) fûn it module-oerfloednivo yn 'e brain-dataset en (ii) de module protein It ferskil wurdt útdrukt yn 'e cerebrospinale floeistof (figuer S5). Lykas earder neamd, wurdt WGCNA brûkt om de module-oerfloed of karakteristike proteinwearde yn 'e harsens te bepalen (13). De fulkaankaart wurdt brûkt om de differinsjaal ekspresje fan modulêre aaiwiten te beskriuwen yn 'e cerebrospinale floeistof (AD / kontrôle). Dizze sifers litte sjen dat trije fan 'e fiif panielen ferskate útdrukkingstrends yn' e harsens en spinale floeistof sjen litte. De twa modules fan it synapsepaniel (M1 en M12) litte in fermindering fan it oerfloednivo yn it AD-harsens sjen, mar oerlaapje signifikant mei it ferhege proteïne yn 'e AD CSF (Figure S5A). De neuron-relatearre modules dy't it metabolome befetsje (M3 en M38) lieten ferlykbere harsens- en cerebrospinal fluid-ekspresjepatroanen ynkonsekwint sjen (figuer S5E). It vaskulêre paniel liet ek ferskate ekspresjetrends sjen, hoewol syn modules (M6 en M15) matig waarden ferhege yn it AD-harsens en fermindere yn 'e sike CSF (figuer S5B). De oerbleaune twa panielen befetsje grutte glial netwurken waans aaiwiten wurde konsekwint up-regulearre yn beide compartments (figuer S5, C en D).
Tink derom dat dizze trends net mienskiplik binne foar alle markers yn dizze panielen. Bygelyks, it synaptyske paniel befettet ferskate aaiwiten dy't signifikant wurde fermindere yn 'e AD-harsens en CSF (figuer S5A). Under dizze down-regulearre cerebrospinal fluid markers binne NPTX2 en VGF fan M1, en chromogranin B fan M12. Nettsjinsteande dizze útsûnderings binne de measte fan ús synaptyske markers lykwols ferhege yn AD spinale floeistof. Oer it algemien wiene dizze analyzes yn steat om statistysk signifikante trends te ûnderskieden yn nivo's fan harsens en cerebrospinale floeistof yn elk fan ús fiif panielen. Dizze trends markearje de komplekse en faaks ferskillende relaasje tusken harsens en CSF-proteinekspresje yn AD.
Dan brûkten wy MS-replikaasje-analyze mei hege trochput (CSF-replikaasje 1) om ús 271-set fan biomarkers te beheinen ta de meast tasizzende en reprodusearjende doelen (figuer 5A). CSF-eksimplaar 1 befettet yn totaal 96-samples fan Emory Goizueta ADRC, ynklusyf kontrôle, AsymAD, en AD-kohort (tabel S1A). Dizze AD-gefallen wurde karakterisearre troch mild kognitive ferfal (gemiddelde MoCA, 20.0 ± 3.8), en feroaringen yn AD-biomarkers befêstige yn cerebrospinale floeistof (tabel S1A). Yn tsjinstelling ta de CSF-analyze dy't wy fûnen, wurdt dizze replikaasje útfierd mei in effisjinter en hege-trochput "single-shot" MS-metoade (sûnder off-line fraksjonearring), ynklusyf in ferienfâldige protokol foar tarieding fan samples dat de needsaak foar immunodepletion fan yndividuele samples elimineert . Ynstee dêrfan wurdt in inkeld "ferbetteringkanaal" mei ymmuniteit brûkt om it sinjaal fan minder oerfloedige aaiwiten te fersterkjen (37). Hoewol it de totale proteoomdekking ferminderet, ferminderet dizze metoade mei ien skot de masinetiid signifikant en fergruttet it oantal TMT-labelde samples dy't libbensfetber analysearre wurde kinne (17, 38). Yn totaal identifisearre de analyze 6,487 peptiden, dy't yn 96 gefallen yn kaart brocht waarden oan 1,183 proteomen. Lykas by de CSF-analyse dy't wy fûnen, waarden allinich dy aaiwiten kwantifisearre yn op syn minst 50% fan 'e samples opnommen yn' e folgjende berekkeningen, en de gegevens waarden werombrocht foar de effekten fan leeftyd en geslacht. Dit late ta de definitive kwantifikaasje fan 792 proteomen, wêrfan 95% ek identifisearre waarden yn 'e CSF-dataset fûn.
(A) Brain-relatearre CSF-proteïnedoelen ferifiearre yn 'e earste replikearre CSF-kohort en opnommen yn it definitive paniel (n = 60). (B oant E) Panel biomarkernivo's (gearstalde z-skoares) mjitten yn 'e fjouwer CSF-replikaasjekohorten. Paired t-tests of ANOVA mei Tukey's postkorreksje waarden brûkt om de statistyske betsjutting fan 'e wizigingen yn oerfloed te evaluearjen yn elke replikate analyze. CT, kontrôle.
Sûnt wy binne benammen ynteressearre yn it ferifiearjen fan ús 271 harsens-relatearre CSF-doelen troch wiidweidige analyse, sille wy fierder ûndersyk fan dit replikearre proteoom beheine ta dizze markers. Under dizze 271 aaiwiten waarden 100 ûntdutsen yn CSF-replikaasje 1. Figure S6A toant de differinsjaal ekspresje fan dizze 100 oerlappende markers tusken de kontrôle- en AD-replikaasjemonsters. Synaptyske en metabolite histones ferheegje it measte yn AD, wylst vaskulêre aaiwiten it meast ferminderje yn sykte. De measte fan 'e 100 oerlappende markers (n = 70) behâlden deselde rjochting fan feroaring yn' e twa datasets (figuer S6B). Dizze 70 validearre brain-relatearre CSF-markers (Tabel S2H) wjerspegelje foar it grutste part de earder waarnommen paniel-ekspresje-trends, dat is de down-regulaasje fan vaskulêre proteïnen en de up-regulaasje fan alle oare panielen. Allinich 10 fan dizze 70 validearre proteïnen lieten feroaringen sjen yn AD-oerfloed dy't dizze panieltrends tsjinsprekke. Om in paniel te generearjen dat de algemiene trend fan 'e harsens en cerebrospinale floeistof it bêste wjerspegelet, hawwe wy dizze 10 proteïnen útsletten fan it paniel fan belang dat wy úteinlik ferifieare (figuer 5A). Dêrom omfettet ús paniel úteinlik in totaal fan 60 proteïnen ferifiearre yn twa ûnôfhinklike CSF AD-kohieren mei ferskate sample-tarieding en MS-platfoarmanalyse. De z-score-ekspresjeplots fan dizze definitive panielen yn 'e CSF-kopy 1-kontrôle en AD-gefallen befêstigje de panieltrend waarnommen yn' e CSF-kohort dy't wy fûnen (Figure 5B).
Under dizze 60 aaiwiten binne d'r molekulen dy't bekend binne dat se assosjearre binne mei AD, lykas osteopontin (SPP1), dat is in pro-inflammatoire cytokine dat is assosjearre mei AD yn in protte stúdzjes (39-41), en GAP43, In synaptysk proteïne dat is dúdlik keppele oan neurodegeneraasje (42). De meast folslein ferifiearre proteïnen binne markers relatearre oan oare neurodegenerative sykten, lykas amyotropyske laterale sklerose (ALS) relatearre superoxide dismutase 1 (SOD1) en Parkinson's sykte relatearre desaccharase (PARK7). Wy hawwe ek ferifiearre dat in protte oare markers, lykas SMOC1 en brain-rike membraan taheaksel signaling protein 1 (BASP1), hawwe beheind eardere keppelings nei neurodegeneraasje. It is de muoite wurdich op te merken dat troch har lege algemiene oerfloed yn it CSF-proteoom, it foar ús lestich is om dizze metoade foar it opspoaren fan ien-shot mei hege trochput te brûken om MAPT en bepaalde oare AD-relatearre aaiwiten betrouber te detektearjen (bygelyks NEFL en NRGN) ) (43, 44).
Wy kontrolearren dan dizze 60 prioriteitspanielmarkers yn trije ekstra replikaatanalyses. Yn CSF Copy 2 brûkten wy in inkele TMT-MS om in ûnôfhinklike kohort fan 297 kontrôle en AD-samples fan Emory Goizueta ADRC (17) te analysearjen. CSF-replikaasje 3 omfette in reanalyze fan beskikbere TMT-MS-gegevens fan 120-kontrôle en AD-pasjinten út Lausanne, Switserlân (45). Wy ûntdutsen mear as twatredde fan 'e 60 prioriteitsmarkers yn elke dataset. Hoewol de Switserske stúdzje ferskate MS-platfoarms en TMT-kwantifikaasjemetoaden brûkt (45, 46), hawwe wy ús panieltrends sterk reprodusearre yn twa werhelle analyzes (figuer 5, C en D, en tabellen S2, I, en J). Om de syktespesifisiteit fan ús groep te evaluearjen, brûkten wy TMT-MS om de fjirde replikaasjegegevensset (CSF-replikaasje 4) te analysearjen, dy't net allinich kontrôle (n = 18) en AD (n = 17) gefallen omfette, mar ek PD ( n = 14)), ALS (n = 18) en frontotemporale demintia (FTD) samples (n = 11) (Tabel S1A). Wy kwantifisearje mei súkses hast twatredde fan 'e panielproteinen yn dizze kohort (38 fan 60). Dizze resultaten markearje de AD-spesifike feroaringen yn alle fiif biomarkerpanielen (figuer 5E en Tabel S2K). De ferheging fan 'e metabolitegroep liet de sterkste AD-spesifisiteit sjen, folge troch de myelinaasje en gliale groep. Yn mindere mjitte lit FTD ek in ferheging sjen tusken dizze panielen, dy't ferlykbere potensjele netwurkferoaringen kinne reflektearje (17). Yn tsjinstelling lieten ALS en PD hast deselde myelinaasje-, glial- en metabolomeprofilen sjen as de kontrôtgroep. Oer it algemien, nettsjinsteande ferskillen yn sample tarieding, MS platfoarm, en TMT kwantifikaasje metoaden, dizze werhelle analyzes litte sjen dat ús prioriteit paniel markers hawwe hege konsekwint AD-spesifike feroarings yn mear as 500 unike CSF samples.
AD neurodegeneraasje is in protte jierren erkend foar it begjin fan kognitive symptomen, dus d'r is in driuwend ferlet fan biomarkers fan AsymAD (5, 31). Hieltyd mear bewiis litte lykwols sjen dat de biology fan AsymAD fier fan homogeen is, en de komplekse ynteraksje fan risiko en fearkrêft liedt ta grutte yndividuele ferskillen yn folgjende sykteprogression (47). Hoewol brûkt om AsymAD-gefallen te identifisearjen, hawwe de nivo's fan kearn CSF-biomarkers (Aβ1-42, totaal tau en p-tau) net bewiisd dat se betrouber kinne foarsizze wa't sil foarútgong nei demintia (4, 7), wat mear oanjout. nedich om holistyske biomarker-ark op te nimmen basearre op meardere aspekten fan harsensfysiology om it risiko fan dizze befolking sekuer te stratifisearjen. Dêrom analysearren wy dêrnei ús AD-validearre biomarkerpaniel yn 'e AsymAD-populaasje fan CSF-kopy 1. Dizze 31 AsymAD-gefallen lieten abnormale kearnbiomarkernivo's sjen (Aβ1-42 / totaal tau ELISA-ferhâlding, <5.5) en folsleine kognysje (gemiddelde MoCA, 27.1 ± 2.2) (Tabel S1A). Dêrnjonken hawwe alle persoanen mei AsymAD in klinyske demintia-score fan 0, wat oanjout dat d'r gjin bewiis is fan in ferfal yn deistige kognitive of funksjonele prestaasjes.
Wy analysearren earst de nivo's fan 'e validearre panielen yn alle 96 CSF-replikaten 1, ynklusyf de AsymAD-kohort. Wy fûnen dat ferskate panielen yn 'e AsymAD-groep signifikante AD-like oerfloedswizigingen hienen, it vaskulêre paniel toande in delgeande trend yn AsymAD, wylst alle oare panielen in opkommende trend sjen litte (figuer 6A). Dêrom lieten alle panielen in heul signifikante korrelaasje sjen mei ELISA Aβ1-42 en totale tau-nivo's (figuer 6B). Yn tsjinstelling is de korrelaasje tusken de groep en de MoCA-score relatyf min. Ien fan 'e mear opfallende fynsten fan dizze analyzes is it grutte oanbod fan paniel-oerfloeden yn' e AsymAD-kohort. Lykas werjûn yn figuer 6A, krúst it panielnivo fan 'e AsymAD-groep gewoanlik it panielnivo fan' e kontrôtgroep en de AD-groep, mei relatyf hege fariabiliteit. Om dizze heterogeniteit fan AsymAD fierder te ûndersykjen, hawwe wy Multidimensional Scaling (MDS) analyse tapast op 96 CSF-replikaasje 1 gefallen. MDS-analyze makket it mooglik om de oerienkomst tusken gefallen te visualisearjen basearre op bepaalde fariabelen yn 'e dataset. Foar dizze klusteranalyse brûke wy allinich dy validearre panielmarkers dy't in statistysk signifikante feroaring hawwe (P <0.05, AD / kontrôle) yn 'e CSF-ûntdekking en replikaasje 1 proteoom (n = 29) (Tabel S2L) nivo. Dizze analyze produsearre dúdlike romtlike klustering tusken ús kontrôle en AD-gefallen (figuer 6C). Yn tsjinstelling binne guon AsymAD-gefallen dúdlik klustere yn 'e kontrôtgroep, wylst oaren lizze yn AD-gefallen. Om dizze AsymAD-heterogeniteit fierder te ferkennen, hawwe wy ús MDS-kaart brûkt om twa groepen fan dizze AsymAD-gefallen te definiearjen. De earste groep omfette AsymAD-gefallen tichter by de kontrôle (n = 19), wylst de twadde groep waard karakterisearre troch AsymAD-gefallen mei in markerprofyl tichter by AD (n = 12).
(A) It ekspresjenivo (z-score) fan 'e CSF-biomarkergroep yn alle 96-samples yn' e CSF-replikaasje 1-kohort, ynklusyf AsymAD. Analyse fan fariânsje mei de postkorreksje fan Tukey waard brûkt om de statistyske betsjutting fan feroaringen yn paniel-oerfloed te evaluearjen. (B) Korrelaasje-analyze fan panielprotein-oerfloednivo (z-score) mei MoCA-score en totaal tau-nivo yn ELISA Aβ1-42 en CSF kopiearje 1-samples. De Pearson-korrelaasjekoëffisjint mei de relevante P-wearde wurdt werjûn. (C) De MDS fan 96 CSF-kopy 1-gefallen wie basearre op 'e oerfloednivo's fan 29 validearre panielmarkers, dy't signifikant feroare waarden yn sawol de ûntdekking as CSF-kopy 1-gegevenssets [P <0.05 AD / kontrôle (CT)]. Dizze analyze waard brûkt om de AsymAD-groep te dielen yn kontrôle (n = 19) en AD (n = 12) subgroepen. (D) It fulkaanplot toant de differinsjaal ekspresje fan alle CSF-replikaasje 1-proteins mei log2-fold feroaring (x-as) relatyf oan de -log10 statistyske P-wearde tusken de twa AsymAD-subgroepen. De panielbiomarkers binne kleurd. (E) CSF-replikaasje 1-oerfloednivo fan 'e seleksjegroep biomarkers wurde differinsjaal útdrukt tusken AsymAD-subgroepen. Tukey's post-oanpast analyse fan fariânsje waard brûkt om statistyske betsjutting te beoardieljen.
Wy ûndersochten de differinsjaal proteïne-ekspresje tusken dizze kontrôle en AD-like AsymAD-gefallen (figuer 6D en Tabel S2L). De resultearjende fulkaankaart lit sjen dat 14 panielmarkers signifikant feroare binne tusken de twa groepen. De measte fan dizze markers binne leden fan 'e synapse en metabolome. SOD1 en myristoylearre alanine-rike proteïne kinase C substraat (MARCKS), dy't lid binne fan respektivelik de myelin- en gliale ymmúngroepen, hearre ek ta dizze groep (figuer 6, D en E). It vaskulêre paniel droech ek twa markers by dy't signifikant fermindere waarden yn 'e AD-like AsymAD-groep, ynklusyf AE-binend proteïne 1 (AEBP1) en oanfolling famyljelid C9. D'r wie gjin signifikant ferskil tusken de kontrôle en AD-like AsymAD-subgroepen yn ELISA AB1-42 (P = 0.38) en p-tau (P = 0.28), mar d'r wie yndie in signifikant ferskil yn it totale tau-nivo (P = 0.0031) ) (Fig. S7). D'r binne ferskate panielmarkers dy't oanjaan dat de feroaringen tusken de twa AsymAD-subgroepen wichtiger binne as de totale tau-nivo's (bygelyks YWHAZ, SOD1, en MDH1) (figuer 6E). Oer it algemien jouwe dizze resultaten oan dat ús falidearre paniel biomarkers kinne befetsje dy't subtype en potinsjele risikostratifikaasje kinne fan pasjinten mei asymptomatyske sykte.
D'r is in driuwend ferlet fan systeem-basearre biomarker-ark om de ferskate patofysiology efter AD better te mjitten en te rjochtsjen. Dizze ark wurdt ferwachte dat se net allinich ús AD-diagnostykkader feroarje, mar ek it oannimmen fan effektive, pasjintspesifike behannelingstrategyen befoarderje (1, 2). Foar dit doel hawwe wy in unbiased wiidweidige proteomika-oanpak tapast op AD-harsens en CSF om web-basearre CSF-biomarkers te identifisearjen dy't in breed oanbod fan harsens-basearre patofysiology reflektearje. Us analyze produsearre fiif CSF biomarker panielen, dy't (i) wjerspegelje synapses, bloedfetten, myeline, immune en metabolic dysfunksje; (ii) demonstrearje sterke reprodusearberens op ferskate MS-platfoarms; (iii) Lit progressive sykte-spesifike feroaringen sjen yn 'e iere en lette stadia fan AD. Oer it algemien fertsjinwurdigje dizze befiningen in belofte stap nei de ûntwikkeling fan ferskate, betroubere, web-rjochte biomarker-ark foar AD-ûndersyk en klinyske tapassingen.
Us resultaten demonstrearje de tige bewarre organisaasje fan it AD-harsensnetwurkproteoom en stypje it gebrûk as anker foar systeem-basearre biomarkerûntwikkeling. Us analyze lit sjen dat twa ûnôfhinklike TMT-MS datasets dy't AD en AsymAD harsens befetsje hawwe sterke modulariteit. Dizze befiningen ferlingje ús foarige wurk, en demonstrearje it behâld fan 'e krêftige modules fan mear as 2,000 harsensweefsels fan meardere ûnôfhinklike kohorten yn' e frontale, parietale en tydlike cortex (17). Dit konsensusnetwurk wjerspegelet ferskate sykte-relatearre feroaringen dy't yn aktueel ûndersyk beoardiele wurde, ynklusyf de ferheging fan glial-rike inflammatoare modules en de fermindering fan neuron-rike modules. Lykas hjoeddeistich ûndersyk, hat dit grutskalige netwurk ek wichtige modulêre feroaringen yn AsymAD, dy't in ferskaat oan ferskillende preklinyske patofysiology sjen litte (17).
Binnen dit tige konservative systeem-basearre ramt is d'r lykwols mear fynkorrelige biologyske heterogeniteit, benammen ûnder yndividuen yn 'e iere stadia fan AD. Us biomarkerpaniel kin twa subgroepen yn AsymAD ôfbyldzje, dy't de signifikante differinsjaal ekspresje fan meardere CSF-markers demonstrearje. Us groep koe de biologyske ferskillen tusken dizze twa subgroepen markearje, dy't net dúdlik wiene op it nivo fan kearn AD-biomarkers. Yn ferliking mei de kontrôtgroep wiene de Aβ1-42 / totale tau-ferhâldingen fan dizze AsymAD-persoanen abnormaal leech. Allinich de totale tau-nivo's wiene lykwols signifikant ferskillend tusken de twa AsymAD-subgroepen, wylst de Aβ1-42- en p-tau-nivo's relatyf fergelykber bleaunen. Sûnt hege CSF-tau liket in bettere foarsizzer fan kognitive symptomen te wêzen as Aβ1-42-nivo's (7), fermoedzje wy dat de twa AsymAD-kohieren ferskate risiko's fan sykteprogression hawwe kinne. Sjoen de beheinde stekproefgrutte fan ús AsymAD en it ûntbrekken fan longitudinale gegevens, is fierder ûndersyk nedich om dizze konklúzjes mei fertrouwen te lûken. Dizze resultaten jouwe lykwols oan dat in systeem-basearre CSF-paniel ús fermogen kin ferbetterje om yndividuen effektyf te stratifisearjen tidens it asymptomatyske stadium fan 'e sykte.
Oer it algemien stypje ús befiningen de rol fan meardere biologyske funksjes yn 'e patogenese fan AD. Dysregulearre enerzjymetabolisme waard lykwols it promininte tema fan al ús fiif validearre labelingpanels. Metabolike aaiwiten, lykas hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) en lactate dehydrogenase A (LDHA), binne de meast robúste validearre synaptyske biomarkers, wat oanjout dat de ferheging fan AD CSF heul reprodusearjende seks is. Us bloedfetten en gliale panielen befetsje ek ferskate markers belutsen by it metabolisme fan oksidative stoffen. Dizze befiningen binne konsistint mei de kaairol dy't metabolike prosessen yn it heule harsens spylje, net allinich om te foldwaan oan 'e hege enerzjyfraach fan neuroanen, mar ek om te foldwaan oan' e hege enerzjyfraach fan astrozyten en oare gliale sellen (17, 48). Us resultaten stypje groeiende bewiis dat feroaringen yn redoxpotinsjeel en ûnderbrekking fan enerzjypaden de kearnferbining kinne wêze tusken ferskate kaaiprosessen belutsen by de patogenesis fan AD, ynklusyf mitochondriale steuringen, glial-bemiddele ûntstekking, en vaskulêre skea (49). Dêrnjonken befetsje de metabolike cerebrospinal fluid biomarkers in grut oantal differinsjaal rike proteïnen tusken ús kontrôle en AD-like AsymAD subgroepen, wat suggerearret dat de fersteuring fan dizze enerzjy- en redoxpaden kritysk wêze kin yn 'e preklinyske faze fan' e sykte.
De ferskate trends fan harsens en cerebrospinale floeistofpanels dy't wy hawwe waarnommen hawwe ek ynteressante biologyske gefolgen. Synapses en metabolomes ryk oan neuroanen litte fermindere nivo's sjen yn 'e AD-harsens en ferhege oerfloed yn cerebrospinale floeistof. Sjoen dat neuroanen ryk binne yn enerzjyprodusearjende mitochondria by synapsen om enerzjy te leverjen foar har tal fan spesjalisearre sinjalen (50), wurdt de oerienkomst fan 'e ekspresjeprofilen fan dizze twa neurongroepen ferwachte. It ferlies fan neuroanen en de extrusion fan beskeadige sellen kinne dizze harsens- en CSF-panieltrends yn lettere sykte ferklearje, mar se kinne de iere panielwizigingen dy't wy observearje net ferklearje (13). Ien mooglike ferklearring foar dizze befiningen yn iere asymptomatyske sykte is abnormale synaptyske snoeien. Nije bewiis yn mûsmodellen suggerearret dat mikroglia-bemiddele synaptyske fagocytosis abnormaal aktivearre wurde kin yn AD en liede ta iere synapseferlies yn it harsens (51). Dit wegere synaptyske materiaal kin accumulearje yn CSF, en dêrom observearje wy de ferheging fan CSF yn it neuronpaniel. Immune-bemiddele synaptyske snoeien kin ek foar in part ferklearje de ferheging fan gliaproteinen dy't wy observearje yn 'e harsens en cerebrospinale floeistof troch it heule sykteproses. Neist synaptyske snoeien kinne algemiene abnormaliteiten yn 'e eksozytyske paad ek liede ta ferskate harsens- en CSF-útdrukkingen fan neuronale markers. In oantal ûndersiken hawwe oantoand dat de ynhâld fan exosomen yn 'e patogenese fan AD-harsens feroare is (52). De ekstrazellulêre paad is ek belutsen by de proliferaasje fan Aβ (53, 54). It is de muoite wurdich op te merken dat ûnderdrukking fan exosomal sekretion AD-like patology kin ferminderje yn AD transgene mûsmodellen (55).
Tagelyk toande it proteïne yn it vaskulêre paniel in matige ferheging fan it AD-harsens, mar signifikant fermindere yn 'e CSF. De bloed-harsensbarriêre (BBB) dysfunksje kin dizze befinings foar in part ferklearje. In protte ûnôfhinklike postmortem minsklike stúdzjes hawwe BBB-ôfbraak yn AD (56, 57) oantoand. Dizze stúdzjes befêstige ferskate abnormale aktiviteiten om dizze strak ôfsletten laach fan endotheliale sellen hinne, ynklusyf brain capillary leakage en perivascular accumulation of bloodborne proteins (57). Dit kin in ienfâldige ferklearring leverje foar de ferhege vaskulêre aaiwiten yn 'e harsens, mar it kin de útputting fan deselde aaiwiten yn' e cerebrospinale floeistof net folslein ferklearje. Ien mooglikheid is dat it sintrale senuwstelsel dizze molekulen aktyf isolearret om it probleem fan ferhege ûntstekking en oksidative stress op te lossen. De reduksje fan guon fan 'e meast earnstige CSF-proteinen yn dit paniel, fral dyjingen dy't belutsen binne by lipoproteinregeling, is relatearre oan it remming fan skealike nivo's fan ûntstekking en it neuroprotective proses fan reaktive soerstofsoarten. Dit is wier foar Paroxonase 1 (PON1), in lipoprotein-binend enzyme ferantwurdlik foar it ferminderjen fan oksidative stressnivo's yn 'e sirkulaasje (58, 59). Alpha-1-microglobulin / bikunin precursor (AMBP) is in oare signifikant delregulearre marker fan 'e vaskulêre groep. It is de foarrinner fan 'e lipidetransporter bikunin, dy't ek belutsen is by ûntstekkingsûnderdrukking en neurologyske beskerming (60, 61).
Nettsjinsteande ferskate nijsgjirrige hypotezen is it ûnfermogen om direkt biogemyske syktemeganismen te detektearjen in bekende beheining fan ûntdekkingsoandreaune proteomika-analyse. Dêrom is fierder ûndersyk nedich om de meganismen efter dizze biomarkerpanielen mei fertrouwen te definiearjen. Om te bewegen nei de ûntwikkeling fan MS-basearre klinyske analyse, fereasket de takomstige rjochting ek it gebrûk fan doelstelde kwantitative metoaden foar grutskalige biomarkerferifikaasje, lykas selektive of parallelle reaksjemonitoring (62). Wy hawwe koartlyn parallelle reaksjemonitoring (63) brûkt om in protte fan 'e CSF-proteinwizigingen te validearjen dy't hjir beskreaun binne. Ferskate prioriteitspanieldoelen wurde kwantifisearre mei signifikante krektens, ynklusyf YWHAZ, ALDOA, en SMOC1, dy't respektivelik kaartsje op ús synapse, metabolisme en ûntstekkingspanielen (63). Independent Data Acquisition (DIA) en oare MS-basearre strategyen kinne ek nuttich wêze foar doelferifikaasje. Budd et al. (64) It waard koartlyn oantoand dat d'r in signifikante oerlap is tusken de AD-biomarkers identifisearre yn ús CSF-ûntdekkingsgegevensset en de ûnôfhinklike DIA-MS-gegevensset, dy't bestiet út hast 200 CSF-samples út trije ferskillende Jeropeeske kohorten. Dizze resinte stúdzjes stypje it potensjeel fan ús panielen om te transformearjen yn betroubere MS-basearre deteksje. Tradysjonele antykladen en aptamer-basearre deteksje is ek wichtich foar de fierdere ûntwikkeling fan wichtige AD-biomarkers. Fanwegen de lege oerfloed fan CSF is it dreger om dizze biomarkers te ûntdekken mei help fan hege-throughput MS-metoaden. NEFL en NRGN binne twa sokke foarbylden fan leech-oerfloed CSF-biomarkers, dy't yn ús wiidweidige analyze oan it paniel yn kaart brocht wurde, mar kinne net betrouber wurde ûntdutsen mei ús single MS-strategy. Targetingstrategyen basearre op meardere antykladen, lykas PEA, kinne de klinyske transformaasje fan dizze markers befoarderje.
Oer it algemien leveret dizze stúdzje in unike proteomika-oanpak foar de identifikaasje en ferifikaasje fan CSF AD-biomarkers basearre op ferskate systemen. It optimalisearjen fan dizze markerpanels oer ekstra AD-kohieren en MS-platfoarms kin belofte bewize om AD-risiko-stratifikaasje en behanneling te befoarderjen. Stúdzjes dy't it longitudinaal nivo fan dizze panielen yn 'e rin fan' e tiid evaluearje, binne ek kritysk om te bepalen hokker kombinaasje fan markers it risiko fan iere sykte en feroaringen yn 'e earnst fan' e sykte it bêste stratifisearret.
Utsein de 3-samples kopiearre troch CSF, waarden alle CSF-samples brûkt yn dizze stúdzje sammele ûnder auspysjes fan Emory ADRC of nau besibbe ûndersyksynstituten. In totaal fan fjouwer sets Emory CSF-samples waarden brûkt yn dizze proteomicsstúdzjes. De CSF-kohort waard fûn om samples te befetsjen fan 20 sûne kontrôles en 20 AD-pasjinten. CSF-eksimplaar 1 omfettet samples fan 32 sûne kontrôles, 31 AsymAD-persoanen, en 33 AD-persoanen. CSF kopy 2 befettet 147 kontrôles en 150 AD samples. De multi-sykte CSF-replikaasje 4-kohort omfette 18-kontrôles, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, en 11 FTD-samples. Neffens de oerienkomst goedkard troch de Emory University Institutional Review Board, krigen alle Emory-stúdzjedielnimmers ynformeare tastimming. Neffens it 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines foar Alzheimer's Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), waard cerebrospinal fluid sammele en opslein troch lumbale puncture. Kontrôle- en AsymAD- en AD-pasjinten krigen standertisearre kognitive beoardieling by Emory Cognitive Neurology Clinic of Goizueta ADRC. Har cerebrospinale floeistofmonsters waarden hifke troch INNO-BIA AlzBio3 Luminex foar ELISA Aβ1-42, totale tau en p-tau analyze (65). ELISA-wearden wurde brûkt om de diagnostyske klassifikaasje fan ûnderwerpen te stypjen basearre op fêststelde AD-biomarker-cut-off-kritearia (66, 67). Basis demografyske en diagnostyske gegevens foar oare CSF-diagnoazen (FTD, ALS, en PD) wurde ek krigen fan Emory ADRC of oansletten ûndersyksynstituten. De gearfettingsmetadata foar dizze Emory CSF-gefallen kinne fûn wurde yn Tabel S1A. De skaaimerken fan 'e Switserske CSF-replikaasje 3-kohort binne earder publisearre (45).
CSF fûn it stekproef. Om de djipte fan ús ûntdekking fan 'e CSF-gegevensset te fergrutsjen, waard ymmúnkonsumpsje fan proteïnen mei hege oerfloed útfierd foardat trypsinisaasje. Koartsein, 130 μl CSF fan 40 yndividuele CSF-monsters en in lykweardich folume (130 μl) fan High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) waarden pleatst yn in spinkolom (Thermo Fisher Scientific, A89868) op keamer temperatuer Incubate). Nei it spinnen foar 15 minuten, sintrifuge it monster foar 2 minuten op 1000g. In 3K ultrasentrifugale filterapparaat (Millipore, UFC500396) waard brûkt om it effluentmonster te konsintrearjen troch 30 minuten op 14,000g te sintrifugearjen. Ferwiderje alle samplevoluminten oant 75 μl mei fosfaatbufferde saline. De proteinkonsintraasje waard evaluearre troch de metoade fan bicinchoninezuur (BCA) neffens it protokol fan 'e fabrikant (Thermo Fisher Scientific). De immunodepleted CSF (60 μl) fan alle 40 samples waard digested mei lysyl endopeptidase (LysC) en trypsin. Koartsein, it probleem waard fermindere en alkylearre mei 1.2 μl 0.5 M tris-2 (-carboxyethyl) -fosfine en 3 μl 0.8 M chloroacetamide by 90 ° C foar 10 minuten, en dan sonicated yn in wetterbad foar 15 minuten. It stekproef waard verdund mei 193 μl 8 M urea buffer [8 M urea en 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] oant in definitive konsintraasje fan 6 M urea. LysC (4,5 μg; Wako) wurdt brûkt foar fersmoarging oernacht by keamertemperatuer. It stekproef waard dan verdund ta 1 M urea mei 50 mM ammoniumbikarbonat (ABC) (68). Foegje in lykweardich bedrach (4,5 μg) trypsin (Promega) ta, en ynkubearje dan it probleem foar 12 oeren. Acidify de digested peptide oplossing ta in definitive konsintraasje fan 1% formic acid (FA) en 0,1% trifluoroacetic acid (TFA) (66), en dan desalt mei in 50 mg Sep-Pak C18 kolom (Waters) lykas hjirboppe beskreaun (25) . It peptide waard doe eluearre yn 1 ml 50% acetonitril (ACN). Om proteïnekwantifikaasje oer batches (25) te standardisearjen, waarden 100 μl aliquots fan alle 40 CSF-samples kombineare om in mingde stekproef te generearjen, dy't doe waard ferdield yn fiif globale ynterne standert (GIS) (48) samples. Alle yndividuele samples en kombinearre noarmen wurde droege troch hege-snelheid fakuüm (Labconco).
CSF kopiearret de stekproef. Dayon en kollega's hawwe earder ymmúnútputting en spiisfertarring beskreaun fan CSF-kopy 3-samples (45, 46). De oerbleaune replikaasjemonsters wiene net yndividueel immunodepleted. Digest dizze net-ferwidere samples yn trypsin lykas earder beskreaun (17). Foar elke werhelle analyze waarden 120 μl aliquots fan 'e elutearre peptide fan elke stekproef tegearre gearfoege en ferdield yn lykweardige folume aliquots om te brûken as de TMT-labele globale ynterne standert (48). Alle yndividuele samples en kombinearre noarmen wurde droege troch hege-snelheid fakuüm (Labconco). Om it sinjaal fan it CSF-proteïne mei lege oerfloed te ferbetterjen, troch it kombinearjen fan 125 μl fan elke stekproef, waard in "ferbettere" stekproef taret foar elke replikaatanalyse [dat wol sizze, in biologyske stekproef dy't it ûndersyksmonster neimakket, mar it beskikbere bedrach is folle grutter (37, 69)] gearfoege yn in mingde CSF stekproef (17). De mingde stekproef waard doe ymmúnferwidere mei 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), digested lykas hjirboppe beskreaun, en opnommen yn 'e folgjende meardere TMT-labeling.
Posttiid: Aug-27-2021